本法(fa)可使抗體或其它(ta)蛋(dan)白質的(de)(de)ε-氨(an)基通過手臂與酰化(hua)的(de)(de)生物素共價結合。其后，生物素(su)(su)化的分(fen)子(zi)可應用酶標-親和(he)素(su)(su)或熒光染料-鏈霉親和(he)素(su)(su)復(fu)合物來檢(jian)測。小分(fen)子(zi)的水(shui)溶(rong)性生物素(su)(su)對細菌蛋白(bai)鏈霉親和(he)素(su)(su)具有高度親和(he)力是本(ben)法的設計基礎。

原料：

NHSB：N-羥(qian)基琥(hu)珀酰亞胺生(sheng)物素

0.1 mol/L 碳酸氫鈉緩沖液，pH 8.0

雙蒸水（注(zhu)意去除游離氨基(ji)），用以配制(zhi)碳酸(suan)氫鈉緩沖(chong)液或硼酸(suan)緩沖(chong)液

DMSO（二甲亞砜，有毒試劑(ji)）

1 mol/L NH4Cl

疊氮鈉（有(you)毒試劑）

PBS

10g/L牛血清白蛋白（W/W）PBS液

分子篩柱（如(ru)G25）

電磁攪拌器

透(tou)析(xi)袋(dai)（MW CO 8000）

鋁(lv)鉑

微量移液器

步驟：

1. 將待生物素(su)化的(de)蛋白質用0.1 mol/L 碳酸(suan)氫鈉(na)緩沖液(ye)（pH 8.0）或0.5 mol/L 硼酸(suan)緩沖液(ye)（pH 8.6）稀釋到1 mg/ml，一般(ban)實驗室(shi)應用的(de)生物素(su)化體積(ji)為1~2.5 ml。

2. 交互用0.1 mol/L 碳(tan)酸氫鈉緩沖(chong)(chong)液（pH 8.0）或0.5 mol/L 硼酸緩沖(chong)(chong)液（pH 8.6），對(dui)蛋白質充分透析。

3. 用1 ml DMSO 溶(rong)解(jie)NHSB 1 mg。

4. 向1 ml 蛋(dan)白質溶液（即(ji)含蛋(dan)白質1 mg）加入(ru)120 μl NHSB溶液（即(ji)含NHSB 120 μg）。

5. 在室溫(wen)下持續攪拌(ban)，保溫(wen)2~4小時。

6. 加入9.6 μL1 mol/L NH4Cl （每25 μg NHSB 加1 μl），在(zai)室溫(wen)下攪拌10分(fen)鐘(zhong)。

7. 在4℃，對(dui)PBS充分透析，以除去游離的生(sheng)物素。

8. 將樣(yang)品上1 ml 的(de)分子篩柱，以PBS緩(huan)慢洗(xi)脫，收(shou)集(ji)1 ml/管，蛋白質(zhi)在1~3 ml 之間(jian)洗(xi)下。

9. 最后，樣品加入疊氮鈉（終(zhong)濃度0.5 g/L）及1.0 g/L BSA。將結(jie)合產物置4℃，避光保存(cun)，亦可加入50%重蒸甘油，置-20℃保存(cun)。

要點：

1. 如在反應(ying)混合液(ye)中有疊氮(dan)鈉或游離(li)氨基存在，會抑制標記反應(ying)。因此(ci)，蛋白(bai)質在反應(ying)前(qian)要對0.1 mol/L 碳酸氫鈉緩沖(chong)液(ye)或0.5 mol/L 硼(peng)酸緩沖(chong)液(ye)

2. 所(suo)(suo)用的(de)NHSB及(ji)待生物素化蛋(dan)白(bai)質之(zhi)間的(de)分子比按(an)蛋(dan)白(bai)質表(biao)面的(de)ε-氨基的(de)密度會(hui)有所(suo)(suo)不同(tong)，選擇不當則影(ying)響標記(ji)的(de)效(xiao)率，應(ying)先用幾個不同(tong)的(de)分子比來篩選最適條件。

3. 用(yong)NHSB量過(guo)量也是(shi)不利的，抗(kang)原的結合位點可(ke)能因此被封閉，導致抗(kang)體失(shi)活(huo)。

4. 由于抗體的氨基不(bu)易接近可(ke)能造成生(sheng)物素化不(bu)足，此時可(ke)加入去污劑(ji)如Triton X-100，Tween 20等(deng)。

5. 當游離ε-氨基(ji)（賴氨酸殘基(ji)的(de)(de)氨基(ji)）存(cun)在(zai)于抗體的(de)(de)抗原結合位(wei)點(dian)(dian)時，或(huo)位(wei)于酶的(de)(de)催化位(wei)點(dian)(dian)時，生物(wu)素化會降低(di)或(huo)損傷抗體蛋(dan)白的(de)(de)結合力或(huo)活性。此時，應試用其它交聯方(fang)法(fa)。

6. 生(sheng)物素還(huan)可能與不同的功能基(ji)(ji)團，如羰(tang)基(ji)(ji)、氨基(ji)(ji)、巰基(ji)(ji)、異咪唑基(ji)(ji)及苯酚基(ji)(ji)，也可與糖(tang)基(ji)(ji)共(gong)價結合(he)。

7. 交聯反應后，應充(chong)分透析，否則，殘余的生(sheng)物素會對生(sheng)物素化(hua)抗體與親和素的結(jie)合產生(sheng)競爭作(zuo)用。

8. 在細(xi)(xi)胞(bao)的熒光標記實驗中，中和親和素的本底(di)低(di)，但由于(yu)鏈霉親和素含有少量正電荷，故對某些(xie)細(xi)(xi)胞(bao)可導致高本底(di)。