一般來說，由(you)于體外診(zhen)斷(duan)試劑只能檢測可溶性蛋(dan)白質的(de)含(han)量，因此(ci)要求樣(yang)本(ben)應清晰透明并(bing)離心除去沉(chen)淀物或懸浮物質。為確保(bao)實(shi)驗的準(zhun)確性(xing)， -20℃或-80℃保(bao)存(cun)的樣本(ben)(ben)應在(zai)1-6個月內(nei)完(wan)成(cheng)檢測，4℃保(bao)存(cun)的樣本(ben)(ben)在(zai)一周內(nei)完(wan)成(cheng)檢測。此(ci)外，樣本(ben)(ben)中不能含有會抑制(zhi)HRP活性的(de)NaN3，否則(ze)會(hui)造成(cheng)假陰性結果(guo)。

可用于體外診(zhen)斷的(de)樣(yang)本一般有血(xue)清、血(xue)漿、尿液、細胞(bao)培養上清以及組(zu)織勻漿等。不同(tong)樣(yang)本類型的(de)預處(chu)(chu)理(li)方法(fa)也(ye)不同(tong)。適當的(de)樣(yang)本預處(chu)(chu)理(li)是(shi)確(que)保體外診(zhen)斷結果正確(que)性(xing)和(he)準確(que)性(xing)的(de)第一步(bu)。這里，我(wo)們將介紹幾種(zhong)不同(tong)樣(yang)本類型的(de)處(chu)(chu)理(li)方法(fa)。

一、液體樣本

液(ye)體樣(yang)本(ben)處理原則：所有的(de)液(ye)體樣(yang)本(ben)，用(yong)無菌管(guan)收集，2-8℃條件離心(xin)20分鐘(zhong)左右（2000-3000轉/分）

1、血清

血清(qing)(qing)是ELISA實驗最常用的樣(yang)本，其預處理(li)也十分簡單(dan)。使用無熱原無內(nei)毒素的試(shi)管(guan)(guan)或(huo)離心管(guan)(guan)采集(ji)血液(ye)樣(yang)本，將試(shi)管(guan)(guan)或(huo)離心管(guan)(guan)在室(shi)內(nei)溫度下放置自然凝固（視室(shi)溫環境10分鐘(zhong)到(dao)2小(xiao)時不等）或(huo)4℃過(guo)夜，分離出血清(qing)(qing)，（建議傾斜試(shi)管(guan)(guan)或(huo)離心管(guan)(guan)以擴大液(ye)面(mian)的橫截面(mian)，使血清(qing)(qing)能更大程(cheng)度的分離出來，），2-6℃條件離心20分鐘(zhong)左右(you)（2000-3000轉(zhuan)/分），仔(zi)細(xi)收集(ji)上(shang)清(qing)(qing)，立即進(jin)行測(ce)定，建議在-20℃或(huo)-80℃下將收集(ji)的血清(qing)(qing)分裝保存，避(bi)免反(fan)復凍融，保存過(guo)程(cheng)中如出現沉淀，應再次離心。

注意事項：在收集血液樣本的過程中應避免溶血，因為紅細胞在溶解時會釋放具有過氧化物酶活性的物質，這種情況下，ELISA實驗中將會出現非特異性顯色反應，導致檢測結果不準確，出現假陽性結果。另外，樣本還應避免細菌污染，因為細菌可能含有內源性HRP，也會導致檢測結果不準確。

2、血漿

應根(gen)據標(biao)本(ben)的要(yao)求選擇EDTA、肝素(su)鈉(na)(na)、枸櫞酸(suan)納或(huo)檸檬酸(suan)鈉(na)(na)作為抗凝劑，使用含抗凝劑的采血管或(huo)離心管采集(ji)(ji)血液樣本，采集(ji)(ji)后(hou)30分(fen)鐘(zhong)內，混合10-20分(fen)鐘(zhong)后(hou)，2-6℃條件離心20分(fen)鐘(zhong)左右（2000-3000轉(zhuan)/分(fen)），仔細(xi)收集(ji)(ji)上清(qing)液（血漿），建議在-20℃或(huo)-80℃下將(jiang)收集(ji)(ji)的血清(qing)分(fen)裝保存，避免(mian)反復凍(dong)融。樣本應避免(mian)溶血或(huo)高血脂。保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。

注意事項：檢(jian)測前請仔細(xi)閱讀ELISA試劑盒說明書，查看(kan)該試(shi)劑盒針對抗凝劑是否(fou)有(you)特殊要求。

3、尿液

用無菌管(guan)收(shou)(shou)集，2-8℃條件(jian)離心20分(fen)鐘左右(you)（2000-3000轉/分(fen)）。仔細(xi)收(shou)(shou)集上清(qing)，保存過程(cheng)中如有沉(chen)淀形成，應(ying)再次離心。

4、細胞培養上清

檢測分(fen)(fen)泌性的成份時，用(yong)(yong)無菌管收(shou)集(ji)。將(jiang)細胞培(pei)養上(shang)清液吸入離(li)心(xin)管中并以2-8℃條件離(li)心(xin)20分(fen)(fen)鐘左右（2000-3000轉/分(fen)(fen)），除去(qu)細胞碎片(pian)和雜(za)質，收(shou)集(ji)上(shang)清液備用(yong)(yong)，樣本保存在-20℃或-80℃，避免反(fan)復凍融(rong)，保存過程中如有(you)沉淀形成，應再次離(li)心(xin)。

細(xi)胞培(pei)養上清作為樣本，干擾因素比較多，不穩(wen)定(ding)，一般的雙抗夾(jia)心法(fa)有可(ke)能檢測不出來，如果經費允許，建議使(shi)用(yong)定(ding)制的競爭(zheng)法(fa)ELISA試(shi)劑盒檢測細(xi)胞上清樣本，江萊(lai)生物，好用(yong)不貴！

5、腦脊液

用(yong)(yong)無(wu)菌(jun)管收集(ji)(ji)，2-8℃條件(jian)離(li)心(xin)20分(fen)鐘左右（2000-3000轉/分(fen)），仔細(xi)收集(ji)(ji)上清，保(bao)存過程(cheng)中如(ru)有(you)(you)沉淀形成，應再次(ci)離(li)心(xin)。（采集(ji)(ji)大(da)(da)(da)鼠(shu)腦脊液(ye)）的方法(fa)：采集(ji)(ji)腦脊液(ye)時(shi)，用(yong)(yong)濕紗(sha)布(bu)擦試大(da)(da)(da)鼠(shu)頸背部皮(pi)膚，剪去背毛(mao)暴露皮(pi)膚。兩(liang)耳連線剪一橫切口(1. 5cm左右)，在其中點向(xiang)尾側(ce)(ce)沿皮(pi)下剪開2cm，將皮(pi)分(fen)離(li)兩(liang)側(ce)(ce)，擴(kuo)大(da)(da)(da)視野。緊(jin)貼大(da)(da)(da)鼠(shu)頭骨依(yi)次(ci)逐層(ceng)剪切各肌層(ceng)，并斷端依(yi)次(ci)拉向(xiang)尾側(ce)(ce)擴(kuo)大(da)(da)(da)視野。注意，有(you)(you)出血(xue)時(shi)用(yong)(yong)干紗(sha)布(bu)按壓止血(xue)，保(bao)持術口清晰。接近頸后(hou)黃韌(ren)帶時(shi)，小心(xin)地用(yong)(yong)7號注射(she)針(zhen)(zhen)頭分(fen)離(li)覆蓋的肌肉，暴露寰枕膜(mo)(mo)。用(yong)(yong)1ml注射(she)器(針(zhen)(zhen)頭用(yong)(yong)止血(xue)鉗使針(zhen)(zhen)尖(jian)與(yu)針(zhen)(zhen)體成150度(du)鈍(dun)角)，針(zhen)(zhen)斜(xie)面向(xiang)上，針(zhen)(zhen)尖(jian)端近水平刺(ci)入(ru)蛛(zhu)網膜(mo)(mo)下腔，固定針(zhen)(zhen)體，緩慢抽取腦脊液(ye)，一般采集(ji)(ji)量為(wei)100-200微升(sheng)。)

6、唾液

用無(wu)菌管收集，2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉/分），仔細收集上清，保存過程中如(ru)有沉淀(dian)形(xing)成，應(ying)再次離心。

二、固體樣本

固(gu)體(ti)樣本(ben)處理原(yuan)則：稱取(qu)1g的固(gu)體(ti)樣本(ben)，用(yong)9ml的合(he)適緩沖(chong)液溶解，分泌蛋白(bai)可(ke)以直接離心(xin)取(qu)上(shang)清檢測，細胞(bao)內的蛋白(bai)，要先收集細胞(bao)，再用(yong)合(he)適方(fang)法破碎，離心(xin)取(qu)上(shang)清測試。

1、組織標本

切割標本后(hou)，稱(cheng)取1g組(zu)(zu)織(zhi)，加入9ml的(de)(de)pH7.2-7.4左右(you)的(de)(de)PBS，用手工或(huo)勻(yun)漿(jiang)(jiang)器將標本勻(yun)漿(jiang)(jiang)充分(fen)(fen)。離心20分(fen)(fen)鐘左右(you)（2000-3000轉/分(fen)(fen)），仔細收集上(shang)清。分(fen)(fen)裝一份(fen)待檢測，其余冷凍備用，保存(cun)過(guo)程中如有沉(chen)淀(dian)形成，應再次離心。對于植物組(zu)(zu)織(zhi)，不(bu)好勻(yun)漿(jiang)(jiang)的(de)(de)話，就在液氮中充分(fen)(fen)研磨。

2、細胞內蛋白樣本

許(xu)多待測蛋(dan)白(bai)不是分泌蛋(dan)白(bai)，而是存在(zai)于細(xi)胞內的蛋(dan)白(bai)，這個時候(hou)，要先收集細(xi)胞，洗滌干凈，再破(po)碎細(xi)胞，離心取上清。

01培養的細胞

A、動物細胞：用PH7.2-7.4的PBS稀釋細胞懸液，使細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融（如果反復凍融，破碎效果不好，就采用超聲波破碎），以使細胞破壞并放出細胞內成份。2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉/分），仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。

B、植物細胞(bao)：用PH7.2-7.4的PBS稀(xi)釋細(xi)胞懸液，使細(xi)胞濃度(du)達(da)到100萬/ml左(zuo)右，置于(yu)冰盒(he)上(shang)，用超(chao)聲破(po)碎儀，設(she)置破(po)碎2s，冷卻30s的方(fang)式，充分(fen)破(po)碎細(xi)胞，以使細(xi)胞破(po)壞并(bing)放(fang)出細(xi)胞內成份。2-8℃條件離(li)心20分(fen)鐘左(zuo)右（2000-3000轉/分(fen)），仔細(xi)收集上(shang)清，保存過(guo)程中如有沉淀形(xing)成，應再次(ci)離(li)心。

02組織的細胞

切割標本(ben)后，稱取1g組織，加入(ru)9ml的pH7.2-7.4左(zuo)右的PBS，用(yong)手(shou)工或勻漿器將標本(ben)勻漿充分。2-8℃條件離心20分鐘左(zuo)右（2000-3000轉/分），去除上(shang)清(qing)，再(zai)(zai)用(yong)pH7.2-7.4左(zuo)右的PBS小(xiao)心洗(xi)滌沉淀的細(xi)胞(bao)三(san)遍。再(zai)(zai)用(yong)上(shang)述的細(xi)胞(bao)破碎(sui)方法破碎(sui)細(xi)胞(bao)。

細胞反復凍融方法

1） 吸出(chu)培(pei)養板中(zhong)的(de)培(pei)養基，用(yong)胰蛋(dan)白酶消化細(xi)胞(bao)，然后加(jia)入適量的(de)培(pei)養基將培(pei)養板上的(de)細(xi)胞(bao)沖(chong)洗干凈。懸(xuan)浮細(xi)胞(bao)可以省略該步驟。

2） 將細(xi)胞(bao)懸浮液收集到離(li)心管中(zhong)，以1000×g離(li)心10分鐘，然后吸去培養(yang)基，用(yong)預冷PBS洗滌細(xi)胞(bao)3次。

3） 加(jia)入(ru)適量的(de)預(yu)冷PBS（建議在使用前立即加(jia)入(ru)蛋白酶抑制劑(ji)）重(zhong)懸(xuan)細胞(bao)。在6孔(kong)(kong)培養(yang)板(ban)中，每個(ge)孔(kong)(kong)需要150-250μL的(de)PBS來重(zhong)懸(xuan)細胞(bao)。

4） 使樣(yang)本在-20℃或-80℃條件(jian)和室溫條件(jian)下反復凍融(rong)，重復凍融過程數次，直(zhi)至細(xi)胞完全(quan)裂解。也可以(yi)使(shi)用超(chao)聲波細(xi)胞破碎器超(chao)聲處理懸浮液來(lai)裂解細(xi)胞。

5） 4℃下以(yi)10,000×g離心10分鐘，去除細胞碎片，收集上清液(ye)， -20℃或-80℃保存，避免反復凍融。

3、土壤

稱取1g土壤，加入(ru)9ml的(de)pH7.2-7.4左右的(de)PBS，用手工將標本充分(fen)(fen)混(hun)勻。2-8℃條件(jian)離心(xin)20分(fen)(fen)鐘左右（2000-3000轉/分(fen)(fen)），仔細(xi)收(shou)集上清。分(fen)(fen)裝一份待檢測，其(qi)余冷凍備用，保存過程中如有(you)沉(chen)淀(dian)形成，應再(zai)次離心(xin)。如果是(shi)測分(fen)(fen)泌蛋白，直接取上清檢測，測試(shi)細(xi)胞(bao)內(nei)蛋白，要破(po)碎細(xi)胞(bao)。

三、植物樣本

1、標本的精采集及保存

取0.1g（誤(wu)差±3%以(yi)內）新鮮植物組織樣本，在液氮中充分(fen)研(yan)磨；加入(ru)1ml的提取液（80%甲(jia)醇）, 置于(yu)-20℃過夜；于(yu)4℃，8000rpm，離心1小(xiao)時，取上清(qing)。

1） 上清液過C-18固(gu)相萃取柱(zhu)。具體步驟是：80%甲醇（1ml）平衡柱(zhu)→上樣(yang)→收集樣(yang)品→移開(kai)樣(yang)品后用(yong)100%甲醇（5ml）洗柱(zhu)→100%乙醚（5ml）洗柱(zhu)→100%甲醇（5ml）洗柱(zhu)→循環。過柱(zhu)后的樣(yang)本真空干(gan)燥或氮氣吹干(gan)，保存備用(yong)。

2） 上(shang)(shang)樣前(qian)加入pH7.4 PBS緩沖液（1ml定(ding)容）。混(hun)勻后室溫放(fang)置30分鐘，然(ran)后4℃離心（8000rpm，15分鐘），取上(shang)(shang)清(qing)并(bing)暫時保存于4℃待用。

2、植物標本中相關酶或蛋白的測定：（粗提取）

新鮮植物組(zu)織(zhi)請在液氮中(zhong)充分研磨；加入樣品體積9倍的(de)提取液（pH 7.4 PBS緩沖液）,請于4℃，8000rpm，離心30分鐘(zhong)，取上(shang)清并暫時保(bao)存于4℃待用。