免疫(yi)診(zhen)斷試劑是廣泛應用的(de)一種測(ce)試系列，通過抗體-抗原結(jie)合(he)來(lai)檢測(ce)特定(ding)目標。這可(ke)能(neng)涉(she)及使用實驗性抗體來(lai)檢測(ce)特定(ding)蛋(dan)白(bai)質的(de)存在，也可(ke)能(neng)使用重組蛋(dan)白(bai)來(lai)檢測(ce)天(tian)然抗體的(de)存在。

在開發、使用免疫診斷試劑或排除故障時，都需要考慮一些共同的影響因素以獲得最佳反應體系系統。本文將介紹一些技巧和竅門，以幫助完善免疫診斷試劑并取得最佳測試結果。

1. 主要原料選擇

花時間選擇一個好的免疫原料會節省大量的檢測開發時間，并產生更好質量的免疫診斷試劑。所選擇的免疫原料最好是純的，并且結構上與目標分析物相同。建議嘗(chang)試多個廠家抗(kang)(kang)體(ti)，這可(ke)能包(bao)括同一(yi)目標的不同表位抗(kang)(kang)體(ti)、多克隆與(yu)單克隆抗(kang)(kang)體(ti)、不同宿主(zhu)物種的抗(kang)(kang)體(ti)，甚至不同供(gong)應(ying)商提(ti)供(gong)的抗(kang)(kang)體(ti)。

抗體(ti)(ti)即使(shi)是來(lai)自不同批次或供應(ying)商(shang)的(de)相同抗體(ti)(ti)，也(ye)(ye)會在檢測效果上表現(xian)出固有(you)差異。不同表位的(de)抗體(ti)(ti)在不同樣品類(lei)型(xing)或條件下結合的(de)可用性(xing)也(ye)(ye)可能不同，所以確保檢測方法與實(shi)際使(shi)用的(de)樣品類(lei)型(xing)相匹(pi)配。

2. 其他輔料影響因數

雖然抗原抗體是免疫檢測的核心，但實驗過程中還涉及一系列其他試劑和材料，這些因素將對檢測結果產生重要影響。

以Western blot為例(li)，可以利用多種具有不同(tong)特性的膜類(lei)型進行印(yin)跡。即使(shi)選(xuan)(xuan)(xuan)擇(ze)(ze)了一種膜類型，在(zai)(zai)不同(tong)制(zhi)造商生產的(de)(de)(de)同(tong)等(deng)膜之間也可(ke)能(neng)存在(zai)(zai)性能(neng)上的(de)(de)(de)差異，橫(heng)向流動膜也是如此。在(zai)(zai)使(shi)用塑(su)料器皿(min)固(gu)定(ding)的(de)(de)(de)免疫診斷試(shi)劑如ELISA時，可(ke)供選(xuan)(xuan)(xuan)擇(ze)(ze)的(de)(de)(de)材料和(he)表面處理(li)以(yi)及結合特性各不相同(tong)，這些因素都會影響(xiang)測定(ding)的(de)(de)(de)有效性。因此，在(zai)(zai)選(xuan)(xuan)(xuan)擇(ze)(ze)合適(shi)的(de)(de)(de)試(shi)劑時，不要滿足于手頭的(de)(de)(de)材料，而是嘗試(shi)不同(tong)的(de)(de)(de)選(xuan)(xuan)(xuan)擇(ze)(ze)和(he)不同(tong)品牌，并(bing)進行平行試驗以找到最(zui)佳結果的產品(pin)。

3. 提供穩定的緩沖液

緩(huan)沖液(ye)提(ti)供了免(mian)疫(yi)診斷試(shi)劑中的(de)(de)反(fan)應環境，所以選擇合適的(de)(de)緩(huan)沖液(ye)條件非常重要。除了嘗試(shi)不同(tong)的(de)(de)緩(huan)沖溶(rong)液(ye)外，還需要嘗試(shi)不同(tong)濃度的(de)(de)溶(rong)液(ye)。

即使是微小的濃度差(cha)異也(ye)(ye)可能(neng)(neng)導致檢(jian)(jian)測成(cheng)功或失敗。這不僅適(shi)用于(yu)檢(jian)(jian)測過(guo)程本身的緩(huan)沖(chong)液，也(ye)(ye)適(shi)用于(yu)上游過(guo)程中使用的緩(huan)沖(chong)液，如重組蛋(dan)白的制備或樣品的儲(chu)存(cun)，因為這些緩(huan)沖(chong)液可能(neng)(neng)會帶入免疫檢(jian)(jian)測中并(bing)產生干(gan)擾(rao)，一定程度上破壞了主(zhu)要原材料(liao)的穩定性。

4. 妥善保管樣品

即使掌(zhang)握(wo)了最佳的檢測(ce)方法，樣(yang)(yang)品質量差或未(wei)得到適當(dang)保(bao)(bao)管(guan)(guan)也可能導致失望的結果。從采集樣(yang)(yang)品開始(shi)，就(jiu)要妥善保(bao)(bao)管(guan)(guan)好樣(yang)(yang)本，我們在(zai)實(shi)際開發(fa)過程中，樣(yang)(yang)本往往是(shi)醫院帶回(hui)來的，在(zai)帶回(hui)途中必須控制(zhi)好儲存穩定！樣(yang)(yang)本包括血液(ye)、血漿、血清、組(zu)織、細胞(bao)、微生(sheng)物(wu)等，保(bao)(bao)管(guan)(guan)得越好，結果就(jiu)越相(xiang)關(guan)和有意(yi)義。

特別是對于(yu)臨床診斷試劑，保存(cun)時(shi)間會影響陽(yang)性(xing)(xing)和陰性(xing)(xing)結果，不論(lun)是假陰性(xing)(xing)還是假陽(yang)性(xing)(xing)結果都是不希望看(kan)到(dao)的。隨著時(shi)間推移，蛋白質(zhi)(zhi)（包括(kuo)抗體）會降(jiang)(jiang)解(jie)，而溫(wen)度升高、pH值變(bian)化(hua)(hua)、滲透壓變(bian)化(hua)(hua)和破壞性(xing)(xing)化(hua)(hua)學物質(zhi)(zhi)等(deng)因(yin)素會加速降(jiang)(jiang)解(jie)。

理想的(de)(de)保管條(tiao)件主要(yao)取決(jue)于樣(yang)品(pin)類(lei)型，所以做足功課很重(zhong)要(yao)。通常，低溫和(he)生物(wu)相關的(de)(de)緩沖條(tiao)件可(ke)能是(shi)最(zui)好的(de)(de)選擇。但對(dui)某些樣(yang)品(pin)類(lei)型可(ke)能導致目(mu)標蛋白的(de)(de)損傷和(he)降解，反復凍融(rong)對(dui)大多數樣(yang)品(pin)肯定是(shi)有害的(de)(de)，必須要(yao)去醫院拿新鮮樣(yang)本測試(shi)開發(fa)。

5. 徹底清洗反應體系

許多免(mian)疫診斷(duan)試劑(ji)都是多組(zu)分(fen)試劑(ji)，需(xu)要儀器進行多次吸取不(bu)(bu)同(tong)試劑(ji)組(zu)分(fen)和樣本，在完成最終動(dong)作之后就(jiu)必須(xu)進行清(qing)洗。雖然清(qing)洗步驟(zou)可(ke)能看起來不(bu)(bu)那么重要，但它(ta)們卻是至關(guan)重要的。清(qing)洗不(bu)(bu)徹(che)底會導(dao)致高(gao)背(bei)景信號，產生“噪音”結果。另一方(fang)面，過(guo)度清(qing)洗可(ke)能使信號減弱(ruo)甚至消失。

在其(qi)他(ta)方(fang)法學(xue)上，不一致(zhi)(zhi)的洗(xi)滌還會帶來(lai)其(qi)他(ta)問題，導致(zhi)(zhi)實驗(yan)(yan)內和(he)實驗(yan)(yan)間的差異以(yi)及結果解釋上的困難(nan)。當整個板塊或(huo)樣品出現(xian)無法解釋的變(bian)化時，可能(neng)是由于單個實驗(yan)(yan)中(zhong)的洗(xi)滌不一致(zhi)(zhi)造成的。

以96孔板式檢測為例，如ELISA，在使用自動洗板機時，最好檢查所有孔是否被均勻清洗。由于自動洗板機所需的細管易堵塞，因此在派發實驗板之前，用一個空板檢查所有孔是否均勻分配和排空。如果使用多(duo)通道(dao)移(yi)液(ye)器手(shou)動(dong)進行操(cao)作，請確保所有吸頭牢固(gu)、平衡地安裝(zhuang)，以防(fang)止洗滌液(ye)的分配和排空不均。例如，在清洗膜時，確保膜完全(quan)浸沒，因為暴露部分將保持未(wei)被清洗。使用磁力(li)攪(jiao)拌(ban)器輕輕攪(jiao)拌(ban)洗滌液(ye)也(ye)是一個好(hao)主(zhu)意（不要過于用力(li)，以免(mian)損(sun)壞膜），以使洗滌液(ye)在整(zheng)個膜上均勻循環。

6. 使用質控品

與大多數測試一樣，包括(kuo)適(shi)當的(de)(de)質控很重要，以確定(ding)實驗(yan)過程(cheng)中獲得的(de)(de)結果的(de)(de)有效性。不包括(kuo)質控意味著無(wu)論結果看起來多么好，都是沒有意義的(de)(de)。

陰性質控可以(yi)將無信號(hao)解(jie)釋(shi)為(wei)沒有目標存在，而不僅僅是檢(jian)測(ce)失敗。例(li)如(ru)，在許多LFA中(zhong)，即使測(ce)試帶是陰性的，也會包括(kuo)一(yi)個控制線(xian)以(yi)確認檢(jian)測(ce)成功。同樣地，陽性質控表明了目標存在(zai)于樣品中的信(xin)號。

例如，在(zai) Western Blot 檢(jian)測細胞裂解液中特定(ding)蛋(dan)白(bai)(bai)時，同時進行(xing)純化的目(mu)標(biao)蛋(dan)白(bai)(bai)樣(yang)品(pin)(pin)可幫助(zhu)識別背(bei)景信號中的目(mu)標(biao)帶。質(zhi)控品(pin)(pin)跨(kua)越目(mu)標(biao)濃度或(huo)表達(da)水平(ping)范圍也有助(zhu)于解釋未知樣(yang)品(pin)(pin)中的水平(ping)，對定(ding)量或(huo)半定量測定特(te)別重(zhong)要。對于ELISAs，確(que)定病(bing)人樣品中(zhong)某種抗體的水平是(shi)低(di)、中(zhong)還是(shi)高(gao)，有助于臨(lin)床解釋，并確(que)保結果保持在(zai)檢測動態范圍內(nei)。

7. 考慮同時檢測多個目標

在(zai)一(yi)次檢測中同(tong)時檢測多個(ge)目標(biao)可能(neng)(neng)是(shi)可取的(de)(de)。添(tian)加一(yi)個(ge)以上的(de)(de)目標(biao)到診斷測試中可以提(ti)高(gao)測定的(de)(de)可靠性、敏感性和(he)特異(yi)性，特別是(shi)當目標(biao)可能(neng)(neng)丟失(shi)或變異(yi)到不能(neng)(neng)有效檢測時。此外，宿主對抗原的(de)(de)反(fan)應存在(zai)自(zi)然差異(yi)，因此將不同(tong)的(de)(de)目標(biao)組合(he)在(zai)一(yi)起(qi)，可以從一(yi)個(ge)樣品中檢測多個(ge)病(bing)原體(ti)或與(yu)之相關(guan)的(de)(de)免疫反(fan)應。

這些建議的目的是幫(bang)助優化免疫(yi)診(zhen)斷試劑并獲得最佳結果。