試(shi)劑的(de)本源在于蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)，穩定性還是在于蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)的(de)有(you)無變化(hua)。下(xia)面將(jiang)一(yi)一(yi)介(jie)紹蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)的(de)注意事項(xiang)。

一、蛋白質失活的原因

在(zai)各種條件(jian)下使用不(bu)同操(cao)(cao)作方法從(cong)細胞環(huan)境中提取蛋白質(zhi)(zhi)將會導(dao)致(zhi)其活(huo)(huo)性(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)丟失(shi)和結構的(de)(de)(de)(de)(de)改變。這些操(cao)(cao)作包括稀(xi)釋，改變溶液條件(jian)，暴露于(yu)各種降解酶、氧氣(qi)、重金屬及各種材，的(de)(de)(de)(de)(de)表面(mian)，以及生(sheng)(sheng)理條件(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)變化 (如凍融(rong)作用) 等。意識到這其中的(de)(de)(de)(de)(de)任(ren)何—個情況都有(you)可(ke)能(neng)影響蛋白質(zhi)(zhi)、了解可(ke)能(neng)采取的(de)(de)(de)(de)(de)盡(jin)量(liang)減(jian)少這些影響的(de)(de)(de)(de)(de)預防措施，都將有(you)助于(yu)確(que)保一個純化草(cao)案的(de)(de)(de)(de)(de)成功。如果在(zai)任(ren)何操(cao)(cao)作過程中發生(sheng)(sheng)目標蛋白質(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)丟失(shi)或失(shi)活(huo)(huo)，那么在(zai)確(que)定這種情況發生(sheng)(sheng)的(de)(de)(de)(de)(de)原因時將通常會提出一個簡單的(de)(de)(de)(de)(de)解決(jue)方案。因此(ci)，如果可(ke)能(neng)的(de)(de)(de)(de)(de)話，檢(jian)查蛋白質(zhi)(zhi)失(shi)活(huo)(huo)是否(fou)伴隨(sui)著蛋白質(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)損失(shi)或其結構的(de)(de)(de)(de)(de)變化，或者是否(fou)蛋白質(zhi)(zhi)仍(reng)然存在(zai)，但(dan)已(yi)失(shi)活(huo)(huo)。這些不(bu)同可(ke)能(neng)性(xing)之(zhi)間的(de)(de)(de)(de)(de)區別可(ke)能(neng)表明了什么類(lei)型的(de)(de)(de)(de)(de)操(cao)(cao)作過程是失(shi)活(huo)(huo)背后的(de)(de)(de)(de)(de)問(wen)題，因此(ci)也指明了一個適當的(de)(de)(de)(de)(de)解決(jue)方案是什么。

二、常規處理方法

顯然，要保(bao)持(chi)蛋(dan)(dan)白質的(de)(de)穩(wen)定，應(ying)避免(mian)可以(yi)使其(qi)變(bian)性(xing)(xing)的(de)(de)處(chu)理方(fang)法。因此，蛋(dan)(dan)白質溶(rong)(rong)液(ye)一(yi)般不要劇烈攪拌或(huo)渦旋，因為這可能(neng)會(hui)(hui)導(dao)致蛋(dan)(dan)白質氧化或(huo)表面變(bian)性(xing)(xing)。蛋(dan)(dan)白質溶(rong)(rong)液(ye)不應(ying)暴(bao)露于極端(duan)的(de)(de) pH、高溫、有機溶(rong)(rong)劑(ji)或(huo)任何其(qi)他(ta)可能(neng)促(cu)進變(bian)性(xing)(xing)的(de)(de)條件(jian)。同樣(yang)，如果(guo)在解凍的(de)(de)狀(zhuang)態下(xia)長(chang)時間儲存一(yi)種蛋(dan)(dan)白質溶(rong)(rong)液(ye)，細菌(jun)和真(zhen)菌(jun)的(de)(de)生長(chang)將(jiang)會(hui)(hui)成為一(yi)個問題。在這樣(yang)的(de)(de)情況(kuang)下(xia)，無菌(jun)溶(rong)(rong)液(ye)和抗(kang)菌(jun)或(huo)抗(kang)真(zhen)菌(jun)試劑(ji)可能(neng)是必要的(de)(de)。最后(hou)，最好使用(yong)蒸(zheng)餾(liu)水配制將(jiang)與蛋(dan)(dan)白質接觸的(de)(de)所有溶(rong)(rong)液(ye)，并且要將(jiang)蒸(zheng)餾(liu)水儲存在無藻類(lei)生長(chang)的(de)(de)容器(qi)中。

三、濃縮和溶劑條件

從細胞(bao)中(zhong)提(ti)取蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)不可(ke)避(bi)免(mian)地(di)導致其所在環(huan)(huan)境(jing)的(de)(de)(de)(de)(de)改變(bian)。由(you)于(yu)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)在體內(nei)一(yi)(yi)般是(shi)穩定的(de)(de)(de)(de)(de)，理論上的(de)(de)(de)(de)(de)目標是(shi)嘗試去(qu)復(fu)制盡(jin)可(ke)能接(jie)近(jin)于(yu)細胞(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)環(huan)(huan)境(jing)，這(zhe)就意味(wei)著高蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)濃(nong)(nong)(nong)度(du)(du)(du)、接(jie)近(jin)中(zhong)性的(de)(de)(de)(de)(de) PH、適中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)離(li)子(zi)強度(du)(du)(du)、還(huan)原狀(zhuang)態(tai)的(de)(de)(de)(de)(de)條件等。實(shi)際上，這(zhe)些(xie)條件中(zhong)有些(xie)是(shi)與蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)純(chun)化(hua)(hua)(hua)相一(yi)(yi)致的(de)(de)(de)(de)(de)，有些(xie)則(ze)不是(shi)。如前所述，保(bao)持(chi)高蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)濃(nong)(nong)(nong)度(du)(du)(du) OlmgZmL) 通常(chang)是(shi)一(yi)(yi)個很好的(de)(de)(de)(de)(de)做法(fa)。這(zhe)將(jiang)(jiang)(jiang)有助(zhu)于(yu)保(bao)持(chi)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)復(fu)合(he)物的(de)(de)(de)(de)(de)狀(zhuang)態(tai)，可(ke)最大限度(du)(du)(du)地(di)減少有害污染物和表(biao)面吸(xi)附作用(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)影(ying)響，而且為(wei)目標蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)提(ti)供(gong)一(yi)(yi)個普(pu)遍(bian)穩定的(de)(de)(de)(de)(de)環(huan)(huan)境(jing)。在蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)純(chun)化(hua)(hua)(hua)的(de)(de)(de)(de)(de)早期保(bao)持(chi)高蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)濃(nong)(nong)(nong)度(du)(du)(du)是(shi)相對比較容(rong)易的(de)(de)(de)(de)(de)，但隨著蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)純(chun)化(hua)(hua)(hua)的(de)(de)(de)(de)(de)進(jin)行(xing)(xing)，這(zhe)將(jiang)(jiang)(jiang)變(bian)得(de)(de)更(geng)加困(kun)難，除非(fei)在每個純(chun)化(hua)(hua)(hua)步驟之(zhi)后都進(jin)行(xing)(xing)一(yi)(yi)次濃(nong)(nong)(nong)縮。因(yin)為(wei)這(zhe)些(xie)后期的(de)(de)(de)(de)(de)過程通常(chang)也存在自身的(de)(de)(de)(de)(de)問(wen)題，所以除非(fei)特殊的(de)(de)(de)(de)(de)穩定性問(wen)題變(bian)得(de)(de)很明(ming)顯，否則(ze)在大多情況(kuang)下，你(ni)可(ke)能不得(de)(de)不接(jie)受稀(xi)溶液。將(jiang)(jiang)(jiang)濃(nong)(nong)(nong)縮蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)純(chun)化(hua)(hua)(hua)步驟與稀(xi)釋蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)純(chun)化(hua)(hua)(hua)步驟進(jin)行(xing)(xing)交(jiao)替的(de)(de)(de)(de)(de)做法(fa)可(ke)能是(shi)有用(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)。例如，將(jiang)(jiang)(jiang)結合(he)到層析柱(zhu)(zhu)上的(de)(de)(de)(de)(de)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)進(jin)行(xing)(xing)一(yi)(yi)次性洗脫(tuo)的(de)(de)(de)(de)(de)操作往往會使(shi)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)濃(nong)(nong)(nong)縮，而梯度(du)(du)(du)洗脫(tuo)則(ze)趨向于(yu)將(jiang)(jiang)(jiang)其稀(xi)釋。使(shi)用(yong)結合(he)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)層析柱(zhu)(zhu)進(jin)行(xing)(xing)純(chun)化(hua)(hua)(hua)趨向于(yu)濃(nong)(nong)(nong)縮, 而凝膠過濾則(ze)會稀(xi)釋。通過明(ming)智的(de)(de)(de)(de)(de)安排純(chun)化(hua)(hua)(hua)步驟，可(ke)能會避(bi)免(mian)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)溶液被過多的(de)(de)(de)(de)(de)稀(xi)釋。

溶液(ye)的(de)(de)條(tiao)(tiao)件也是極其重要(yao)的(de)(de)。雖然(ran)不可能描述出適用(yong)于(yu)每一個蛋(dan)白(bai)質(zhi)的(de)(de)一種(zhong)通用(yong)穩定溶液(ye)的(de)(de)配制(zhi)方法(fa)，但(dan)對于(yu)某種(zhong)蛋(dan)白(bai)質(zhi)來說，添加特(te)定的(de)(de)組分(fen)通常是有用(yong)的(de)(de)。這(zhe)些條(tiao)(tiao)件包括能夠避免(mian)不必要(yao)的(de)(de) pH 變化的(de)(de)緩沖(chong)體(ti)系，體(ti)系的(de)(de) PH 通常在中(zhong)性附近。應(ying)該(gai)特(te)別注意緩沖(chong)液(ye)的(de)(de)陰離子，因為很多情(qing)況下 Cr 可能是有害的(de)(de)。EDTA 通(tong)常(chang)以約 0.Immol/L 的(de)濃度添加，用(yong)(yong)以螯合可能與蛋白質相互作用(yong)(yong)或促進氧(yang)化的(de)重金(jin)屬離子。還原劑（如 2-疏基乙醇或二硫蘇糖(tang)醇) 通(tong)常(chang)用(yong)(yong)于對抗氧(yang)化作用(yong)(yong)，尤其是半胱氨酸殘基的(de)氧(yang)化。可優先使用(yong)(yong) 0.1?Immol/L 的(de)二硫蘇糖醇，因為它不(bu)能(neng)和蛋白質(zhi)(zhi)形成分子(zi)(zi)間二(er)硫鍵，而 2-疏(shu)基(ji)乙醇可(ke)以(yi)。溶(rong)液中(zhong)應加人(ren)(ren)足夠的(de)(de)(de)還(huan)原劑，如(ru)果還(huan)原劑過少(shao), 蛋白質(zhi)(zhi)會(hui)在其耗(hao)盡(jin)后(hou)由于失去保護而被氧化。在某些情(qing)況下(xia)(xia)(xia)，要(yao)加人(ren)(ren)鹽以(yi)保持(chi)一(yi)定的(de)(de)(de)離子(zi)(zi)強度, 但僅(jin)限于當它們與下(xia)(xia)(xia)一(yi)步的(de)(de)(de)純化或分析步驟(zou)相兼容的(de)(de)(de)情(qing)況下(xia)(xia)(xia)使用。同樣,5%?20% 的(de)(de)(de)甘油往(wang)往(wang)有(you)助于保持(chi)穩定, 并且這些濃度適用于大多數純化步驟(zou)。有(you)時(shi)，需要(yao)加人(ren)(ren)低水(shui)平(ping)的(de)(de)(de)非離子(zi)(zi)去污劑以(yi)防止蛋白質(zhi)(zhi)聚集或吸附到所使用器材(cai) (如(ru)玻璃(li)器皿）的(de)(de)(de)表面。最后(hou)，加人(ren)(ren)蛋白酶抑制劑是一個很(hen)好(hao)的(de)(de)做法(fa)，特(te)別是在早期的(de)(de)操作步驟之中。

四、穩定性實驗和儲存條件

在(zai)(zai)一(yi)(yi)種新蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質的(de)(de)(de)純(chun)化(hua)(hua)過程(cheng)(cheng)中(zhong)，最重要(yao)(yao)(yao)的(de)(de)(de)研究(jiu)之(zhi)一(yi)(yi)是(shi)(shi)(shi)穩(wen)定(ding)性(xing)(xing)(xing)和存儲(chu)研究(jiu)。這(zhe)(zhe)意味(wei)著在(zai)(zai)純(chun)化(hua)(hua)過程(cheng)(cheng)的(de)(de)(de)每(mei)個(ge)(ge)(ge)步驟之(zhi)后，一(yi)(yi)定(ding)要(yao)(yao)(yao)檢測(ce)感(gan)興趣(qu)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質的(de)(de)(de)穩(wen)定(ding)性(xing)(xing)(xing)和存儲(chu)性(xing)(xing)(xing)。雖然快(kuai)捷的(de)(de)(de)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質純(chun)化(hua)(hua)過程(cheng)(cheng)是(shi)(shi)(shi)人們所期望的(de)(de)(de)，但經常(chang)會發生一(yi)(yi)些意外情況，特(te)別是(shi)(shi)(shi)在(zai)(zai)一(yi)(yi)個(ge)(ge)(ge)新的(de)(de)(de)純(chun)化(hua)(hua)過程(cheng)(cheng)中(zhong)，在(zai)(zai)進(jin)(jin)(jin)行(xing)下一(yi)(yi)個(ge)(ge)(ge)純(chun)化(hua)(hua)步驟之(zhi)前需要(yao)(yao)(yao)將蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質放(fang)置一(yi)(yi)段時(shi)間(jian)的(de)(de)(de)時(shi)候。為此，你(ni)需要(yao)(yao)(yao)知道它在(zai)(zai)不同(tong)(tong)儲(chu)藏條(tiao)(tiao)件下的(de)(de)(de)穩(wen)定(ding)性(xing)(xing)(xing)。最簡單(dan)的(de)(de)(de)測(ce)試辦法是(shi)(shi)(shi)取少量蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質溶液，將它們存儲(chu)在(zai)(zai)不同(tong)(tong)的(de)(de)(de)條(tiao)(tiao)件下 (如儲(chu)存于冰上、將其(qi)冰凍或(huo)在(zai)(zai)室溫下存放(fang)，以及加人或(huo)不加人穩(wen)定(ding)劑），然后在(zai)(zai)不同(tong)(tong)的(de)(de)(de)時(shi)間(jian)段檢測(ce)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質的(de)(de)(de)活性(xing)(xing)(xing)。另外，要(yao)(yao)(yao)知道下一(yi)(yi)個(ge)(ge)(ge)純(chun)化(hua)(hua)步驟是(shi)(shi)(shi)什(shen)么。一(yi)(yi)些存儲(chu)條(tiao)(tiao)件對穩(wen)定(ding)很好(hao)，但不利于進(jin)(jin)(jin)一(yi)(yi)步的(de)(de)(de)純(chun)化(hua)(hua)。一(yi)(yi)個(ge)(ge)(ge)恰當的(de)(de)(de)例子(zi)是(shi)(shi)(shi)于一(yi)(yi) 20°C 將蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質存儲(chu)在(zai)(zai) 50% 的(de)(de)(de)甘油 (V/Y) 通(tong)常(chang)是(shi)(shi)(shi)保(bao)持穩(wen)定(ding)的(de)(de)(de)一(yi)(yi)個(ge)(ge)(ge)有用條(tiao)(tiao)件，但如果你(ni)要(yao)(yao)(yao)進(jin)(jin)(jin)行(xing)進(jin)(jin)(jin)一(yi)(yi)步的(de)(de)(de)純(chun)化(hua)(hua)，這(zhe)(zhe)是(shi)(shi)(shi)相當可(ke)怕的(de)(de)(de)。有時(shi)可(ke)能有必要(yao)(yao)(yao)應(ying)用這(zhe)(zhe)樣的(de)(de)(de)程(cheng)(cheng)序(xu)，即通(tong)過透析去除(chu)甘油，但這(zhe)(zhe)一(yi)(yi)般是(shi)(shi)(shi)最后采用的(de)(de)(de)解決措施。

當你(ni)完成了(le)純(chun)化流程(cheng)并(bing)準備長(chang)時間存儲所純(chun)化的蛋白質時，一個不(bu)同的情況出現了(le)。

在(zai)這里, 主(zhu)要(yao)(yao)關注(zhu)的(de)(de)(de)(de)是(shi)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)長(chang)期穩定(ding)(ding)性，很多在(zai)純化(hua)過程中不實用(yong)的(de)(de)(de)(de)條件(jian)(jian)現在(zai)變得可用(yong)。這些可能(neng)包括加(jia)人(ren)高濃度的(de)(de)(de)(de)甘油、加(jia)人(ren)穩定(ding)(ding)性基質(zhi)(zhi), 甚至(zhi)加(jia)入其(qi)他蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi) (如(ru)血(xue)清白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)）。儲存條件(jian)(jian)的(de)(de)(de)(de)選擇取決于什(shen)么(me)對蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)穩定(ding)(ding)是(shi)有效的(de)(de)(de)(de)，以及(ji)純化(hua)的(de)(de)(de)(de)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)將(jiang)要(yao)(yao)作何用(yong)。如(ru)果你(ni)主(zhu)要(yao)(yao)的(de)(de)(de)(de)興趣(qu)是(shi)研(yan)(yan)究酶的(de)(de)(de)(de)活(huo)性，那(nei)么(me)血(xue)清白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)的(de)(de)(de)(de)存在(zai)可能(neng)無關緊要(yao)(yao)。相(xiang)比(bi)之下(xia)，如(ru)果你(ni)想要(yao)(yao)研(yan)(yan)究蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)結構，那(nei)么(me)就不希望有其(qi)他蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)存在(zai)。如(ru)果你(ni)不確定(ding)(ding)，最(zui)好是(shi)將(jiang)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)分裝(zhuang)并存儲在(zai)不同的(de)(de)(de)(de)條件(jian)(jian)下(xia)。

蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)存儲的(de)(de)相(xiang)關問(wen)題還有(you)純(chun)化蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)溶(rong)液的(de)(de)凍(dong)(dong)融(rong)(rong)。避免反復(fu)(fu)凍(dong)(dong)融(rong)(rong)的(de)(de)一(yi)種方式(shi)是將純(chun)化的(de)(de)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)分裝成小份，每次按需(xu)(xu)取出(chu)其中(zhong)的(de)(de)一(yi)份或(huo)(huo)幾(ji)份融(rong)(rong)解(jie); 另外，將蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)存儲在(zai)非凍(dong)(dong)結的(de)(de)條(tiao)(tiao)件下(xia)，如一(yi) 2 〇°C 條(tiao)(tiao)件下(xia) 50% 的(de)(de)甘油中(zhong)。如果需(xu)(xu)要(yao)反復(fu)(fu)凍(dong)(dong)融(rong)(rong), 最(zui)好(hao)是使用快速的(de)(de)凍(dong)(dong)融(rong)(rong)程(cheng)序。在(zai)冷凍(dong)(dong)過程(cheng)中(zhong)，溶(rong)質(zhi)(zhi)(zhi)濃縮, 蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)可能會暴露于異常惡劣的(de)(de)條(tiao)(tiao)件中(zhong)。我(wo)們通常將蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)速凍(dong)(dong)于干冰(bing)-乙醇浴以(yi)避免這個問(wen)題。同(tong)樣，對解(jie)凍(dong)(dong)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)溶(rong)液也應該快速地進行，將其置于緩(huan)慢攪(jiao)拌的(de)(de)溫水(shui)浴中(zhong)，直到樣品溶(rong)解(jie)到僅剩(sheng)少量的(de)(de)冰(bing)塊時取出(chu)。在(zai)使用過程(cheng)中(zhong), 溶(rong)液解(jie)凍(dong)(dong)后放(fang)置于冰(bing)上或(huo)(huo)室(shi)溫條(tiao)(tiao)件下(xia)。最(zui)后解(jie)凍(dong)(dong)的(de)(de)溶(rong)液應該輕(qing)輕(qing)地混合，如果溶(rong)液在(zai)管中(zhong)可以(yi)顛倒，以(yi)確保溶(rong)質(zhi)(zhi)(zhi)均(jun)勻(yun)分布(bu)。

五、蛋白質水解和蛋白酶抑制劑

蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)水(shui)解(jie)是(shi)蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)純(chun)化(hua)的(de)(de)(de)(de)一個主(zhu)要問(wen)題。因(yin)為在(zai)很多(duo)情況下目(mu)(mu)標蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)在(zai)部分降解(jie)時仍能保(bao)留生物(wu)(wu)活性(xing)，所(suo)以這(zhe)是(shi)一個特(te)別(bie)潛在(zai)的(de)(de)(de)(de)問(wen)題。而且這(zhe)一現象這(zhe)可(ke)能會(hui)導致在(zai)進行蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)大(da)小和(he)結(jie)構分析時得出錯誤(wu)的(de)(de)(de)(de)結(jie)論(lun)。蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)水(shui)解(jie)可(ke)能出現在(zai)純(chun)化(hua)過(guo)程的(de)(de)(de)(de)任(ren)何(he)階段。因(yin)為純(chun)化(hua)過(guo)程總是(shi)趨(qu)向于(yu)消除這(zhe)些具有水(shui)解(jie)活性(xing)的(de)(de)(de)(de)污染物(wu)(wu), 所(suo)以一般來說總的(de)(de)(de)(de)水(shui)解(jie)活性(xing)在(zai)初始的(de)(de)(de)(de)粗提取(qu)物(wu)(wu)中是(shi)最高(gao)的(de)(de)(de)(de)。然而，粗提物(wu)(wu)中也存(cun)在(zai)著很多(duo)可(ke)能會(hui)保(bao)護目(mu)(mu)標蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)。在(zai)純(chun)化(hua)過(guo)程中, 一種蛋(dan)白(bai)酶(mei)微量的(de)(de)(de)(de)污染甚至會(hui)產生很大(da)的(de)(de)(de)(de)影響，因(yin)為大(da)部分可(ke)接觸的(de)(de)(de)(de)蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)底(di)物(wu)(wu)可(ke)能都是(shi)你(ni)所(suo)需的(de)(de)(de)(de)目(mu)(mu)標蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)。

如(ru)(ru)果在特定的(de)(de)(de)情況下(xia)蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)水解是一個問題，你怎么判(pan)斷呢？最(zui)簡單(dan)的(de)(de)(de)測試方(fang)法是將提取物(wu)或(huo)部(bu)分純化(hua)的(de)(de)(de)蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)在溫和的(de)(de)(de)溫度下(xia)孵育(yu) (如(ru)(ru) 30°C)，分時(shi)間(jian)段取出部(bu)分樣(yang)品進行生物(wu)活(huo)性的(de)(de)(de)分析(xi)。雖(sui)然這種方(fang)法并非(fei)萬無一失(shi)(shi)，因為可能會有其他原(yuan)因導(dao)致蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)失(shi)(shi)活(huo)，但(dan)大多數蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)在這樣(yang)的(de)(de)(de)條(tiao)件(jian)下(xia)不(bu)會熱失(shi)(shi)活(huo)。如(ru)(ru)果活(huo)性喪失(shi)(shi)，建(jian)議添加蛋(dan)白(bai)(bai)酶抑(yi)制劑，因為在純化(hua)過程中(zhong)即使是將蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)保持在 0?4°C 的(de)(de)(de)條(tiao)件(jian)下(xia)也會發生一些裂(lie)解，除非(fei)蛋(dan)白(bai)(bai)酶滅(mie)活(huo)。

細胞(bao)中含有多種(zhong)不同的蛋白(bai)(bai)酶(mei)類。幸運(yun)的是(shi)，可用(yong)蛋白(bai)(bai)酶(mei)抑制劑(ji)作用(yong)于(yu)各種(zhong)蛋白(bai)(bai)酶(mei)。

蛋(dan)(dan)白(bai)酶(mei)抑(yi)(yi)制(zhi)劑(ji)用于特定(ding)(ding)的(de)(de)(de)情況或系(xi)統(tong)在本書其他(ta)章節(jie)中有所描述。對于一(yi)(yi)個(ge)(ge)新的(de)(de)(de)蛋(dan)(dan)白(bai)質最好的(de)(de)(de)辦(ban)法(fa)是(shi)使(shi)用混合的(de)(de)(de)能夠對不(bu)(bu)同種類蛋(dan)(dan)白(bai)質起作用的(de)(de)(de)蛋(dan)(dan)白(bai)酶(mei)抑(yi)(yi)制(zhi)劑(ji)。這些蛋(dan)(dan)白(bai)酶(mei)抑(yi)(yi)制(zhi)劑(ji)混合物是(shi)可(ke)以(yi)買(mai)到(dao)的(de)(de)(de)。一(yi)(yi)旦獲得了(le)保持(chi)目標蛋(dan)(dan)白(bai)質穩(wen)定(ding)(ding)性(xing)的(de)(de)(de)條件, 可(ke)以(yi)將(jiang)(jiang)蛋(dan)(dan)白(bai)酶(mei)抑(yi)(yi)制(zhi)劑(ji)逐一(yi)(yi)去除以(yi)確(que)定(ding)(ding)哪一(yi)(yi)個(ge)(ge)蛋(dan)(dan)白(bai)酶(mei)抑(yi)(yi)制(zhi)劑(ji)是(shi)必需的(de)(de)(de)。將(jiang)(jiang)會涉及一(yi)(yi)些反復實驗, 以(yi)便確(que)定(ding)(ding)哪些抑(yi)(yi)制(zhi)劑(ji)是(shi)純化過程所需要的(de)(de)(de)而哪些則不(bu)(bu)是(shi)。請注(zhu)意(yi)，蛋(dan)(dan)白(bai)酶(mei)抑(yi)(yi)制(zhi)劑(ji)在一(yi)(yi)定(ding)(ding)條件下(xia)是(shi)有毒的(de)(de)(de)和/或不(bu)(bu)穩(wen)定(ding)(ding)的(de)(de)(de)。在沒(mei)有研究(jiu)清楚它們的(de)(de)(de)性(xing)質之前請不(bu)(bu)要使(shi)用。

六、蛋白質活性丟失

在蛋白質(zhi)(zhi)(zhi)純(chun)化(hua)(hua)(hua)過程中通常聽到的(de)(de)(de)(de)哀(ai)嘆是:「我的(de)(de)(de)(de)蛋白質(zhi)(zhi)(zhi)失(shi)去了活(huo)性。」當(dang)這種情況發生時(shi)，需(xu)要(yao)仔細分析情況，以查(cha)明原因。最重要(yao)的(de)(de)(de)(de)是，你應該仔細計算酶單位，以評(ping)估活(huo)力損失(shi)的(de)(de)(de)(de)程度。對于許(xu)多純(chun)化(hua)(hua)(hua)步(bu)驟，損失(shi)高(gao)達 50% 的(de)(de)(de)(de)比(bi)例是正常的(de)(de)(de)(de)，當(dang)然，蛋白質(zhi)(zhi)(zhi)活(huo)性損失(shi)的(de)(de)(de)(de)情況對每個蛋白質(zhi)(zhi)(zhi)是不一樣的(de)(de)(de)(de)。一般(ban)來(lai)說，包含有將(jiang)蛋白質(zhi)(zhi)(zhi)與基(ji)質(zhi)(zhi)(zhi)結合, 并且在結合的(de)(de)(de)(de)過程中可能需(xu)要(yao)發生構象(xiang)變化(hua)(hua)(hua)的(de)(de)(de)(de)純(chun)化(hua)(hua)(hua)步(bu)驟相比(bi)于凝(ning)膠(jiao)過濾來(lai)說對蛋白質(zhi)(zhi)(zhi)活(huo)性的(de)(de)(de)(de)影響更(geng)大。

如果在(zai)某(mou)一(yi)個純化步驟蛋白質的活性完全喪失，需(xu)要考慮其(qi)他的可(ke)(ke)能(neng)性。第一(yi)種可(ke)(ke)能(neng)是在(zai)某(mou)些情況下, 蛋白質可(ke)(ke)能(neng)與層析(xi)柱結合得(de)非(fei)常緊密(mi)，需(xu)要使(shi)用更加(jia)極端的洗脫程序(xu)。根(gen)據層析(xi)的類(lei)型(xing) (見本書第 6 部(bu)分(fen)和第 7 部(bu)分(fen))，可(ke)(ke)能(neng)需(xu)要增加(jia)離子強度、使(shi)用一(yi)個離液序(xu)列比(bi)較(jiao)高的鹽 (如 KBr)，或在(zai)洗脫液中加(jia)入去污劑或乙二(er)醇。

第二(er)種(zhong)可能是(shi)蛋白質(zhi)活(huo)性(xing)(xing)的(de)(de)(de)發揮(hui)需要(yao)多個(ge)組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)分(fen)(fen)(fen), 這(zhe)(zhe)些組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)分(fen)(fen)(fen) (如另一個(ge)亞基或輔因子）在分(fen)(fen)(fen)級分(fen)(fen)(fen)離(li)過(guo)程中被除去(qu)(qu)了(le)。因此，無論哪一種(zhong)組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)分(fen)(fen)(fen)其(qi)(qi)(qi)本(ben)身是(shi)無活(huo)性(xing)(xing)的(de)(de)(de)，只(zhi)有在所有組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)分(fen)(fen)(fen)出現時才(cai)可觀察(cha)到活(huo)性(xing)(xing)。為了(le)測試(shi)這(zhe)(zhe)種(zhong)可能性(xing)(xing)，可將前一步中的(de)(de)(de)所有組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)分(fen)(fen)(fen)混(hun)合到一起，再檢測其(qi)(qi)(qi)活(huo)性(xing)(xing)。在某(mou)些情(qing)況下(xia), 有必要(yao)將混(hun)合物(wu)濃縮到原來的(de)(de)(de)體積去(qu)(qu)觀察(cha)其(qi)(qi)(qi)活(huo)性(xing)(xing)。如果(guo)混(hun)合所有的(de)(de)(de)組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)分(fen)(fen)(fen)后再次檢測到了(le)活(huo)性(xing)(xing)，則應(ying)該以(yi)配對的(de)(de)(de)方式檢測這(zhe)(zhe)些組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)分(fen)(fen)(fen)或組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)分(fen)(fen)(fen)群。經常(chang)會(hui)發現某(mou)個(ge)組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)分(fen)(fen)(fen)有微量的(de)(de)(de)活(huo)性(xing)(xing)而需要(yao)第二(er)種(zhong)組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)分(fen)(fen)(fen)以(yi)達到最佳的(de)(de)(de)活(huo)性(xing)(xing)。此時，所需要(yao)的(de)(de)(de)一種(zhong)組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)分(fen)(fen)(fen)已(yi)經很(hen)明(ming)確(que)了(le)，而其(qi)(qi)(qi)他組(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)(zu)分(fen)(fen)(fen)可以(yi)通過(guo)測試(shi)其(qi)(qi)(qi)刺激活(huo)性(xing)(xing)來確(que)定。

有時在純化步驟之間蛋白質可能會喪(sang)失活(huo)性，如在透(tou)析或濃縮過程(cheng)中(zhong)，或甚至(zhi)在存儲過程中。對于前者，你應該再(zai)次檢測除去(qu)(qu)一種可(ke)能需要的(de)(de)組分所產生(sheng)的(de)(de)結果。也有(you)這樣的(de)(de)可(ke)能性, 就是蛋白(bai)質依附在透析管或(huo)濃縮(suo)膜(mo)上。對此，用含有(you)一定(ding)去(qu)(qu)污劑的(de)(de)緩(huan)沖液沖洗這些管或(huo)膜(mo)可(ke)能會有(you)所幫助。存儲(chu)過程中的(de)(de)穩定(ding)性問(wen)題在上面已經有(you)所討論(lun)。

最令人沮喪的(de)情況是以上(shang)所有(you)的(de)可能(neng)性中沒(mei)有(you)一種(zhong)是蛋白質失(shi)活(huo)的(de)原因。在這種(zhong)情況下, 最可能(neng)的(de)解釋是蛋白質因變性、水解等確實失活(huo)了。如果(guo)可以(yi)獨立檢測蛋(dan)白(bai)質 (如 WesternBlot 法），這種情況可以(yi)直接顯示。如果(guo)不行，可能(neng)需要進行反(fan)復實驗 (trialanderrorexperiment) 檢測各(ge)種條件來尋找失活(huo)的(de)原因。有時，最好的(de)辦法是避(bi)免(mian)特殊的(de)純化步驟(zou)。

少量(liang)(liang)純(chun)化(hua) (低于(yu)毫克級蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)量(liang)(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)純(chun)化(hua)) 的(de)(de)(de)(de)(de)(de)操作要(yao)注意(yi)一系列特殊問(wen)題。尤(you)其是要(yao)特別注意(yi)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)因吸(xi)(xi)附于(yu)各種表(biao)(biao)面(mian)而損失(shi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)可能(neng)性。少量(liang)(liang)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)與某些表(biao)(biao)面(mian)結(jie)合(he)緊密，如(ru)玻璃表(biao)(biao)面(mian)和多種塑料(liao)表(biao)(biao)面(mian)，常(chang)常(chang)會高達 Iyg/cm2。在少量(liang)(liang)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)純(chun)化(hua)過程(cheng)中，由于(yu)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)總(zong)量(liang)(liang)本來就很少，所以(yi)這些因吸(xi)(xi)附而損失(shi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)量(liang)(liang)可占到相當大(da)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)比例。當然，你應該避免使用聚苯(ben)乙烯材料(liao)制(zhi)成的(de)(de)(de)(de)(de)(de)容器 (如(ru)微量(liang)(liang)滴定盤），因為它具有較(jiao)高的(de)(de)(de)(de)(de)(de)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)結(jie)合(he)能(neng)力。在這樣的(de)(de)(de)(de)(de)(de)情況下(xia)，管道應仔細地沖洗以(yi)確保蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)最(zui)大(da)回收率。此外，低濃度非離子型(xing)去(qu)污(wu)劑的(de)(de)(de)(de)(de)(de)存在可能(neng)有助于(yu)防止(zhi)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)與表(biao)(biao)面(mian)結(jie)合(he)。在整個過程(cheng)中，小心地計算蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)量(liang)(liang)是相當重要(yao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)，這可能(neng)會提醒研究者在哪里發(fa)生了不必要(yao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)損失(shi)。