對蛋白質進行標記和偶聯操作可以賦予其新的功能，便于檢測、定位或者用于構建復雜的生物分子體系。其中，基于氨基反應的蛋白質標記和偶聯方法是一類非常重要的技術手段。

1、氨基在(zai)蛋白質中的存(cun)在(zai)形(xing)式(shi)與特性

1）氨基酸結構中的氨基：蛋白(bai)質(zhi)由(you)氨(an)基(ji)(ji)酸(suan)組成，許多氨(an)基(ji)(ji)酸(suan)都(dou)含有(you)氨(an)基(ji)(ji)基(ji)(ji)團（-NH?）。在(zai)組成蛋白(bai)質(zhi)的(de)20種常見氨(an)基(ji)(ji)酸(suan)中，例如賴氨(an)酸(suan)（Lys），其側鏈上含有(you)一(yi)個可反(fan)應的(de)氨(an)基(ji)(ji)。這些(xie)氨(an)基(ji)(ji)在(zai)蛋白(bai)質(zhi)的(de)三(san)維結(jie)構中分布在(zai)不同的(de)位置，有(you)的(de)暴(bao)露在(zai)蛋白(bai)質(zhi)表面，容易(yi)與外界試劑發生反(fan)應，而有(you)的(de)可能由(you)于蛋白(bai)質(zhi)折疊(die)而被包埋(mai)在(zai)內部，不易(yi)被觸及。

2）氨基的化學性質：氨基具有(you)一定的堿性(xing)(xing)，可(ke)以(yi)接受質(zhi)子(zi)形成 -NH??。這種堿性(xing)(xing)特性(xing)(xing)使(shi)得氨基在不同(tong)的pH條件下具有(you)不同(tong)的反(fan)應(ying)(ying)活(huo)性(xing)(xing)。在偏中性(xing)(xing)到堿性(xing)(xing)的環境中，氨基能(neng)夠(gou)與帶有(you)活(huo)性(xing)(xing)官能(neng)團的化合(he)物發(fa)生親核取代反(fan)應(ying)(ying)或縮(suo)合(he)反(fan)應(ying)(ying)等(deng)。氨基可(ke)以(yi)與羧基發(fa)生縮(suo)合(he)反(fan)應(ying)(ying)形成酰胺(an)鍵，這一反(fan)應(ying)(ying)在蛋白質(zhi)偶聯(lian)過(guo)程(cheng)中經常被利用。

2、常見的基于氨基反應的蛋白質標記和偶聯方法

1）戊二醛法：戊二醛是一種帶有兩個活性醛基的雙功能連接劑。它能夠借助兩端的醛基與蛋白質的氨基以共價鍵連接。反應機制涉及到醛基與氨基首先反應生成亞胺（西佛堿，schiff base）。反應條件相對溫和，可以在4-40°C，pH 6.8-9之間反應，反應時間通常控制在2-5小時。一般室溫下即可反應，如果反應物活性較高，也可以在4°C條件下反應。在磷酸緩沖液（pH6.8- 7.5）或者碳酸緩沖液（pH8-9）中都能進行反應，而且通常pH越高，西弗堿的生成率越高。這種方法的優點是操作簡單，連接效率較高。然而，也存在一些局限性，例如生成的西佛堿在反應條件下不是很穩定，可能會發生進一步的聚合反應，需要對反應條件進行精確的控制以確保偶聯的穩定性。

2）碳化二亞胺法：碳(tan)化(hua)二亞(ya)胺(an)(an)類試劑（如EDC）是常(chang)用的偶聯試劑。它(ta)能(neng)夠活(huo)(huo)化(hua)含(han)有羧基的化(hua)合(he)物，使其與(yu)蛋白(bai)質的氨基發(fa)生(sheng)反(fan)(fan)(fan)應(ying)(ying)(ying)形成酰胺(an)(an)鍵(jian)。在(zai)反(fan)(fan)(fan)應(ying)(ying)(ying)過程中，碳(tan)化(hua)二亞(ya)胺(an)(an)首先與(yu)羧基反(fan)(fan)(fan)應(ying)(ying)(ying)形成一個活(huo)(huo)性(xing)中間(jian)(jian)體(ti)(ti)，這個中間(jian)(jian)體(ti)(ti)隨后與(yu)氨基反(fan)(fan)(fan)應(ying)(ying)(ying)完成偶聯。反(fan)(fan)(fan)應(ying)(ying)(ying)通常(chang)在(zai)水相體(ti)(ti)系中進(jin)行，并且(qie)可以(yi)通過調(diao)節pH來(lai)優(you)(you)化(hua)反(fan)(fan)(fan)應(ying)(ying)(ying)效率。一般來(lai)說，pH在(zai)4.5-6.0之間(jian)(jian)比較適(shi)合(he)。優(you)(you)點是可以(yi)在(zai)水溶液(ye)中進(jin)行反(fan)(fan)(fan)應(ying)(ying)(ying)，對(dui)許多生(sheng)物分子的活(huo)(huo)性(xing)影響較小(xiao)。但是，反(fan)(fan)(fan)應(ying)(ying)(ying)過程中可能(neng)會產生(sheng)一些副反(fan)(fan)(fan)應(ying)(ying)(ying)，需(xu)要對(dui)反(fan)(fan)(fan)應(ying)(ying)(ying)體(ti)(ti)系進(jin)行適(shi)當的優(you)(you)化(hua)以(yi)提高(gao)特異性(xing)。

3）重氮法：芳香族伯胺在低溫（0 - 5°C）和強酸（鹽酸或硫酸）溶液中與亞硝酸鈉作用，生成重氮鹽的反應稱為重氮化反應。若環上具有 -NO?或 -SO?H等的芳胺可以在較高一些（40-60°C）溫度進行重氮化反應。重氮鹽在弱酸、中性或堿溶液中與含有氨基的蛋白質作用，由偶氮基（N = N）將兩個分子偶聯起來，生成偶氮化合物的反應，稱為偶聯反應。這種方法的偶聯反應是親電取代反應，重氮陽離子是弱的親電試劑，它進攻蛋白質氨基所在位置苯環上電子出現幾率密度比較大的碳原子。反應需要嚴格控制反應條件，包括溫度、pH和反應物濃度等，以確保反應的特異性和效率。

3、蛋白質標記和偶聯過程中的關鍵因素

1）緩沖液(ye)體系：緩沖液(ye)的種類(lei)和(he)pH值對氨基反應(ying)(ying)的偶(ou)聯過(guo)程至關重要(yao)。不同(tong)的偶(ou)聯方法(fa)可(ke)能需(xu)要(yao)特定(ding)的pH范(fan)圍來確保反應(ying)(ying)的最佳(jia)效(xiao)率。例如，碳化二亞胺法(fa)在(zai)pH4.5-6.0之(zhi)間較(jiao)為(wei)合適(shi)，而戊二醛法(fa)在(zai)pH6.8-9之(zhi)間反應(ying)(ying)較(jiao)好。合適(shi)的緩沖液(ye)還可(ke)以維持蛋白質的結構和(he)活性，防止(zhi)蛋白質在(zai)反應(ying)(ying)過(guo)程中(zhong)變性。

2）反應溫度和時間：反(fan)應(ying)溫(wen)度和時間需要根據具體的(de)(de)偶聯方法和反(fan)應(ying)物(wu)的(de)(de)特(te)性(xing)來(lai)確定。一般(ban)來(lai)說(shuo)，較低(di)的(de)(de)溫(wen)度可(ke)以減少副反(fan)應(ying)的(de)(de)發生，但可(ke)能(neng)會降(jiang)低(di)反(fan)應(ying)速率。戊二(er)醛法在室溫(wen)到40°C都可(ke)以反(fan)應(ying)，而重(zhong)氮(dan)法需要嚴格控制溫(wen)度在0 - 5°C或(huo)(huo)者40 - 60°C（根據芳(fang)胺(an)的(de)(de)結構(gou)）。反(fan)應(ying)時間過(guo)長可(ke)能(neng)會導致不必要的(de)(de)副反(fan)應(ying)或(huo)(huo)者蛋白質變性(xing)，時間過(guo)短則可(ke)能(neng)導致偶聯不完(wan)全。

3）反應物濃度和比例：蛋白質(zhi)與標記(ji)或偶聯(lian)試劑(ji)的(de)濃(nong)度(du)和比例會影響(xiang)偶聯(lian)的(de)效率和特異性。如果標記(ji)試劑(ji)濃(nong)度(du)過高，可(ke)能會導(dao)致(zhi)非特異性結合或者過度(du)修(xiu)飾(shi)，影響(xiang)蛋白質(zhi)的(de)活性。如果濃(nong)度(du)過低，則可(ke)能導(dao)致(zhi)偶聯(lian)不完(wan)全(quan)。