在分(fen)子生物學實驗中，堿(jian)裂(lie)解(jie)法(fa)是一(yi)種常用(yong)的提取(qu)(qu)質粒DNA的方法(fa)。然而，有時會(hui)出(chu)現堿(jian)裂(lie)解(jie)法(fa)提取(qu)(qu)的質粒溶液(ye)中不含DNA和RNA的情況(kuang)，這(zhe)涉及多個方面的因素.......

第一，我們需要了解堿裂解法的基本原理和正常操作流程。

堿裂解法(fa)主要依賴三種溶(rong)液的作用：

溶液I：用于重懸菌體，其成分包括葡萄糖、Tris-Cl和EDTA，葡(pu)萄糖(tang)增加粘稠度(du)，減(jian)少搖晃時(shi)對DNA的機械(xie)剪切力，EDTA則螯合(he)二價金屬離(li)子，抑制DNase的活性和微生物生長。

溶液II：含有(you)NaOH和SDS，NaOH負責(ze)裂解(jie)菌體細(xi)胞(bao)壁、在(zai)細(xi)胞(bao)膜上穿孔，釋放質粒，而SDS為(wei)下(xia)一步操(cao)作做鋪墊(dian)。

溶液III：則用于沉淀雜質，其中KAc置換SDS中的(de)鈉離子(zi)形成不(bu)溶性(xing)(xing)的(de)PDS，HAc中和(he)NaOH，防止(zhi)長時(shi)間的(de)堿性(xing)(xing)條件打(da)斷DNA。、

正常情況下，經過這一系列操作以及后續的酚/氯仿/異戊醇抽提和酒(jiu)精沉淀，應該能夠獲得(de)含有(you)質粒DNA的溶(rong)液。

第二，為什么會出現提取的質粒溶液中不含DNA和RNA的情況呢？

從(cong)操作過程來(lai)看，存在以下關鍵問(wen)題：

1，在溶液I的使用環節，如果菌體沒有懸浮均勻，存在結塊現象，就會導致后續的裂解不充分。部分菌體沒有被完全裂解，其中的質粒DNA就無法釋放出來，最終導致提取的溶液中沒有DNA。

2，溶液II的操作也至關重要，NaOH必須使用新鮮的，因為如果NaOH吸收了空氣中的CO2，堿性會減弱，無法有效溶解大腸桿菌，從而難以高效率抽提得到質粒。而且，裂解細胞過程中，堿處(chu)理(li)的(de)(de)時間(jian)(jian)要(yao)短且不能激烈(lie)振(zhen)蕩。若堿處理時間(jian)(jian)過(guo)長或振(zhen)蕩過(guo)于(yu)劇烈(lie)，基因組DNA容易發生(sheng)斷裂(lie)，50 -100kb大小(xiao)的(de)(de)片斷就無(wu)法被(bei)PDS共沉淀，會混入最終的(de)(de)溶液(ye)中，同時也可能破壞質(zhi)粒DNA的(de)(de)結構，導致(zhi)無(wu)法有效提取到質(zhi)粒DNA。

3，溶液III加入后，會出現大量沉淀，這與SDS的加入有關。如果在溶液II中未添加SDS，雖然也會有少量沉淀，但沉淀效果不佳，無法有效去除雜質，影響最終質粒的提取。而HAc若未能有效中(zhong)和NaOH，長時(shi)間(jian)的(de)堿性環境會打斷DNA，使得DNA無法完整地存(cun)在(zai)于最(zui)終的(de)質粒溶液中(zhong)。

4，酚/氯仿/異戊醇抽提步驟也不容忽視，酚對蛋白質的變性作用強，但水飽和酚比重略比水重，在高濃度鹽溶液中離心后酚相會跑到上層，不利于含質粒的水相回收，所以加入氯仿增加比重，使酚/氯仿始終在下層方便回收水相，而異戊醇讓離心后上下層界面更清晰。如果在這個抽提過程中操作不當，例如分層不清晰導致水相回收失敗，或者酚/氯仿比例不準確，都可能導致質粒DNA丟失。另外，若單獨用酚抽提(ti)后(hou)未(wei)用氯(lv)仿去除水相中的(de)酚，酚會抑(yi)制后(hou)續(xu)的(de)酶(mei)反(fan)應，也可能影(ying)響(xiang)質粒的(de)提(ti)取(qu)和檢測，給(gei)人溶液中不含DNA的(de)假象。

5，酒精沉淀環節，回收后的水相含有足夠多的鹽，加入2倍體積的乙醇在室溫放置幾分鐘后離心可沉淀出質粒DNA。但如果放置在-20℃時間過長，會導致大量鹽的沉淀，干擾質粒DNA的沉淀，甚至可能誤認為沒有提取到質粒DNA。

此外，最終溶解質粒的TE緩沖液(ye)若存在問題，比如其中的(de)RNase活性不(bu)足，無法有(you)效(xiao)降(jiang)解RNA，或(huo)者TE緩(huan)沖液(ye)本身(shen)被污染(ran)，都可能(neng)導致RNA殘留或(huo)質粒DNA被破壞，從(cong)而(er)出(chu)現溶液(ye)中看(kan)似不(bu)含DNA和RNA的(de)情況。