PCR反應的(de)(de)(de)關(guan)鍵因素主(zhu)要有引物的(de)(de)(de)選擇(ze)與設計，酶(mei)的(de)(de)(de)質(zhi)量.模(mo)(mo)(mo)板(ban)(ban)(ban)的(de)(de)(de)制(zhi)備，在(zai)前二者(zhe)都穩定可行(xing)的(de)(de)(de)情況下(xia)，PCR模(mo)(mo)(mo)板(ban)(ban)(ban)的(de)(de)(de)制(zhi)備尤為重要。模(mo)(mo)(mo)板(ban)(ban)(ban)處理方法的(de)(de)(de)選擇(ze)及操作(zuo)人(ren)員的(de)(de)(de)基 本(ben)技能，決(jue)定分離(li)模(mo)(mo)(mo)板(ban)(ban)(ban)核(he)酸(DNA或RNA)的(de)(de)(de)質(zhi)和量及PCR的(de)(de)(de)成敗.而提(ti)高(gao)模(mo)(mo)(mo)板(ban)(ban)(ban)核(he)酸質(zhi)量的(de)(de)(de) 關(guan)鍵是(shi)除去雜質(zhi)(蛋白(bai)質(zhi)、酶(mei)、脂肪等(deng))。除去抑(yi)制(zhi)Taq DNA聚合酶(mei)活性抑(yi)制(zhi)因子，提(ti)高(gao) 模(mo)(mo)(mo)板(ban)(ban)(ban)核(he)酸的(de)(de)(de)產(chan)量。

傳統的核酸模板提取方法是采用去垢劑如SDS等來破壞細胞組份，溶解細胞膜，使蛋白質變性，再用蛋白酶K來消化去除蛋白質。

尤其是與DNA結合的蛋白質，再用 酚:氯仿抽提，然后用乙醇或異丙醇沉淀核酸，供PCR實驗用。但近幾年來也發展了些 簡便實用較為有效的標本消化處理方法。亦可滿足PCR實驗的要求。采用哪種方法消化處理標本，視PCR實驗的目的(是科研還是檢測)及環境條件而定。

模板核酸的提取制備方法

(一(yi))蛋白酶K消化裂解法：

適用于所有(you)標本的消化處理，尤以DNA樣品為佳。如組織細(xi)胞(包括石蠟包埋(mai)組織)絨毛(mao)、毛(mao)發、精斑、血(xue)(xue)液(血(xue)(xue)清(qing)、血(xue)(xue)漿、全血(xue)(xue))局部分泌(mi)物、尿，糞(fen)便(bian)等。

1. 試劑配制

①蛋白酶K消化(hua)液:10mmol/L Tris.cl(PH8.0)

　　10mmol/LEDTA

　　150mmol/LNaCL

　　0.5%SDS

　　100～200ug/ml蛋白酶(mei)K

②蛋白酶K最好(hao)用水(shui)配(pei)成20mg/ml，臨用時加入消化液(ye)中。

2. 提取方法

有(you)些標(biao)本、在(zai)用蛋白酶K消化前，還需預處(chu)理一下，如糞便、分泌物、痰液(ye)、組(zu)織(zhi)塊、石蠟(la)包(bao)埋組(zu)織(zhi)等(deng)，其方法有(you)離心去掉(diao)雜質，脫(tuo)蠟(la)等(deng)。

臨床標(biao)本(ben)或經預處(chu)理(li)的標(biao)本(ben)加蛋白酶K裂解(jie)液50～100ul。混勻，55℃1～3小時，或37℃過夜。加等體(ti)(ti)積的飽和酚抽(chou)(chou)提1～2次，再(zai)加等體(ti)(ti)積的氯仿(fang):異戊(wu)醇(chun)(49:1)抽(chou)(chou)提一(yi) 次，上(shang)清加入1/10體(ti)(ti)積的pH值(zhi)5.23mmol/L醋酸鈉緩(huan)沖(chong)液，加入2.5倍體(ti)(ti)積的冰冷無(wu)水 乙(yi)醇(chun)(或加等體(ti)(ti)積的異丙醇(chun))-20℃放置至(zhi)少(shao)3h。

取出(chu)后14000轉/min離心(xin)15min.小心(xin)吸棄或倒出(chu)上清(qing)，沉淀加入75%冰冷乙醇15000r/min5min離心(xin)洗滌1～2次，特別小心(xin)的吸棄或倒掉(diao)上清(qing)，真空或37℃溫(wen)箱或室(shi)溫(wen)干(gan)燥，加TE緩沖液20ul.溶解后，取3～8ul 用于PCR擴增(zeng)，或放-20℃保存。

蛋(dan)白(bai)(bai)酶K消(xiao)化法除上(shang)述經典處理法外(wai)，亦可在蛋(dan)白(bai)(bai)K消(xiao)化處理標本，經離(li)心處理后，吸(xi)取上(shang)清經95～97℃或(huo)煮(zhu)沸10min滅(mie)活(huo)蛋(dan)白(bai)(bai)酶K后，直接作(zuo)核酸模板(ban)用(yong)于PCR擴增。如(ru)雜質(zhi)較(jiao)多，還(huan)可經酚:氯仿抽提(ti)后，即可用(yong)于PCR反應.此法蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)及(ji)其它雜質(zhi)消(xiao)除 徹底，Taq酶活(huo)性不受影響(xiang)，具有良好的重復性與(yu)穩定(ding)性.但操作(zuo)繁(fan)復，技術要求(qiu)高。

(二)直接裂解法: 

標本(ben)(組織細(xi)(xi)胞(bao)，分泌(mi)物(wu))加(jia)PBS或生理(li)(li)鹽水(shui)離(li)心(xin)洗(xi)滌(di)后，加(jia)消化裂解(jie)液(ye)20～50ul(0.5%NP-40和0.5%吐溫-20)，95～98℃，15～30min以(yi)裂解(jie)病(bing)原(yuan)體， 裂解(jie)細(xi)(xi)胞(bao).然后12000r/min離(li)心(xin)5～10min，取(qu)上清20～30ul用于PCR擴增(zeng)。血(xue)清標本(ben)可(ke) 直(zhi)加(jia)等(deng)體積的(de)消化液(ye)，加(jia)熱處理(li)(li)離(li)心(xin)后PCR擴增(zeng)。亦有用5%的(de)NP-40和1.5%2-ME做裂解(jie)液(ye)，95℃30min消化處理(li)(li)，離(li)心(xin)取(qu)上清，PCR擴增(zeng)檢測HBV DNA。

(三)堿變(bian)性法: 

取血清(qing)20ul，加入1mol/L NaOH 20ul，37℃30min，離心(xin)，加 1mol/L HCl 20ul，離心(xin)后，取上清(qing)5ul，用于(yu)PCR擴增。*亦(yi)有用10ul血清(qing)加NaOH至 0.2mol/L，37℃1h，再加HCL中和(he)離心(xin)后取上清(qing)10ul做PCR，其(qi)特(te)異性(xing)和(he)敏感性(xing)較前法更好。

(四)煮沸法:

經(jing)離(li)心洗滌過的(de)組織細胞(bao)，分泌物(wu)及血(xue)液標本(ben)，加適量無菌蒸餾水或(huo)PBS，混(hun)勻后(hou)，100℃煮(zhu)沸10～15min，14000r/min 10min，取上清做PCR。

(五)碘化鈉(na)法: 

取組織細胞(bao)及抗凝(ning)血液10～100ul，加(jia)(jia)等體積(ji)的(de)6MNaI，反復輕混(hun) 20s，加(jia)(jia)等體積(ji)氯仿(fang): 異戊醇(49:1)振勻后(hou)，離心(xin)取上清加(jia)(jia)0.6體積(ji)的(de)異丙醇，混(hun)勻后(hou) 置室(shi)溫3min。14000r/min 10min，沉(chen)淀(dian)加(jia)(jia)10～100ul，TE溶解(jie)，取5～10ul做PCR。

亦有用100ul血(xue)清(qing)加裂解(jie)液(ye)300ul(6M NaI，0.5%十二烷(wan)基肌酸(suan)鈉，10ug糖原，26mmol/L pH8.0 Tris-HCL，13mmol/LEDTA)混勻后，60℃15min，加等(deng)體(ti)積(ji)異(yi)丙醇，離心沉淀后，加TE液(ye)用于PCR擴增，其(qi)產量(liang)和質量(liang)較高。

(六)異硫氰酸胍法

此法主要用(yong)于RNA的(de)提取(qu).標本為組織細胞及血清等.

1.異硫氰酸胍消化(hua)液

異硫氰酸胍4mol/L

檸檬酸鈉(PH7.0)25mmol/L

十二烷基肌酸鈉0.5%

β-巰基乙醇0.1mol/L

2.消化方法:

用50～100ul細(xi)胞懸液(ye)及血清，加(jia)(jia)等體(ti)積(ji)的(de)異硫(liu)氰酸胍(gua)消化液(ye)振(zhen)混勻 后，或65℃1小時，或室溫放置數(shu)分鐘，然(ran)后加(jia)(jia)1/10體(ti)積(ji)的(de)3mmol/L pH5.2的(de)醋酸鈉緩 沖(chong)液(ye)，再(zai)加(jia)(jia)等體(ti)積(ji)的(de)酚:氯仿，用力(li)振(zhen)搖約10s，10000r/min，離心5min取上清。

加等體積異丙醇-20℃放置3h后，14000r/min離(li)心15min，沉定用75%冰(bing)冷乙醇離(li)心洗(xi)滌1～ 2次，真空干燥(zao)，沉淀用TE緩沖液(ye)溶解即可用于逆(ni)轉錄PCR擴增，或放-20℃保(bao)存.

其它消化(hua)處理標本提模板核酸(suan)(suan)的方法(fa)(fa)(fa)(fa)有①異硫氰酸(suan)(suan)胍一二氧化(hua)硅法(fa)(fa)(fa)(fa)②異硫氰酸(suan)(suan)胍 -玻(bo)璃粉法(fa)(fa)(fa)(fa).③Chelex-100法(fa)(fa)(fa)(fa).④全血直接(jie)擴(kuo)增(zeng)法(fa)(fa)(fa)(fa)⑤尿素消化(hua)裂解法(fa)(fa)(fa)(fa).各有千秋，可根據 情況選用。