講這個問題之前，首先問大家一個問題，為什么微流控成本這(zhe)么高，大家還不(bu)遺余力地去(qu)做探索？答案就在這個“控”字上。對于免疫層析，樣本爬樣有點太隨意了，完全處于一個不受控的狀態，爬樣狀態和結果就像擲骰子，即使我們把能做的功課都做足了，也難免有個別的樣本跟你調皮一下，非得不按套路出牌。雖然這個概率可能不到1%，但是從產品每年的出貨量考慮，比如出貨量是20萬人份/年，不合格條數就是2000條，這2000條不知道會招來多少個投訴。微流控分為被動微流控和主動微流控，被動微流控一般都是僅靠虹吸去爬樣，做到相對可控；主動微流控則會加上傳感器，根據壓力去控制流樣完全可控。當初這個概念剛出來的時候，我就覺得這確實是掀桌子的一個壯舉，但是奈何成本高出普通的膜墊層析太多，并不適合大眾普及。

       再講一個問題，問一下做過層析的同學，層(ceng)析產品是定(ding)性(xing)好做，還是定(ding)量(liang)好做，或者(zhe)是半定(ding)量(liang)好做？前些天有人說，好做順序：定量產品＞定性＞半定量。從我個人而言，我沒法給出結論，只能說各有難點。定性產品哪里難？特異性！陰性樣本不允許出現一絲絲的條帶；半定量產品哪里難？不僅僅不讓出假陽，還得嚴格地卡住半定量的那幾個點的條帶深淺；定量產品哪里難？cv不好把控，跟發光產品比，可能就是個學渣級別的，但是陰性樣本允許存在一定的背景條帶，因為軟件可以扣除，講到這里，我大概明白那個朋友做這個排序的依據了，他肯定是做定性產品做多了??！

       上面(mian)我們說(shuo)到(dao)了，和微流(liu)控(kong)的(de)精裝(zhuang)修相比(bi)，膜墊搭配的(de)層析就像個毛坯房，樣品墊+結合墊+nc膜+吸水紙，永(yong)恒不變的(de)幾大版塊。那么(me)層析這么(me)大的(de)cv，到(dao)底(di)能(neng)不能(neng)控(kong)一下呢(ni)(ni)？在哪里控(kong)呢(ni)(ni)？

1.結合墊(dian)用什么？

       和(he)(he)微(wei)球直(zhi)接接觸的就(jiu)是結合墊，它的類(lei)別直(zhi)接影(ying)響了微(wei)球的釋放狀態。它的種(zhong)類(lei)實在太多了，目(mu)前最(zui)主流的就(jiu)是玻纖和(he)(he)聚酯，但是我們(men)似乎(hu)并不在乎(hu)它是什么材質，好用(yong)就(jiu)行。從我個人(ren)的角度(du)，我喜歡(huan)將它們(men)分類(lei)成以(yi)下幾個方面(mian)：

A常見的玻纖。像是(shi)奧斯龍的8964，表面(mian)(mian)上絲(si)(si)絲(si)(si)縷縷的，親水(shui)性(xing)特別好，蓄水(shui)量也特別足，釋放(fang)速度(du)快，殘留少，是(shi)很多人非(fei)常喜歡的一款玻纖。但是(shi)，我個(ge)人覺(jue)得(de)，對(dui)于很多新手，可能覺(jue)得(de)它(ta)并(bing)不好用(yong)，因(yin)為它(ta)對(dui)于CV方面(mian)(mian)的把控并(bing)不是(shi)特別好，因(yin)為材(cai)質表面(mian)(mian)的絲(si)(si)絲(si)(si)縷縷，讓很多人做出來的試紙條(tiao)Stream都非(fei)常嚴重，跑出來的線條(tiao)也是(shi)絲(si)(si)絲(si)(si)縷縷，深(shen)深(shen)淺淺，CV自然也就(jiu)大了。

B常(chang)見的(de)(de)聚酯。聚酯的(de)(de)種類(lei)非(fei)常(chang)多，有(you)(you)像(xiang)打(da)印紙一樣(yang)致密的(de)(de)，也有(you)(you)像(xiang)奶酪(lao)的(de)(de)表面一樣(yang)坑(keng)坑(keng)洼洼的(de)(de)。它(ta)們的(de)(de)特點就是親水性(xing)普遍都很(hen)(hen)好，釋放很(hen)(hen)柔和(he)也很(hen)(hen)徹底(di)，整體的(de)(de)cv把控要比常(chang)見的(de)(de)玻纖(xian)要好一些(xie)，雖然成(cheng)本高一些(xie)，但更適合(he)新手拿來(lai)做定(ding)量產(chan)品。

C疏水性(xing)材(cai)質。很(hen)多(duo)人做(zuo)時間分辨也(ye)(ye)好，上(shang)轉(zhuan)發(fa)(fa)光也(ye)(ye)罷，微球的(de)釋(shi)放對(dui)(dui)他(ta)們來說總是個大問題(ti)。我(wo)用過很(hen)多(duo)公司的(de)產(chan)品，發(fa)(fa)現(xian)很(hen)多(duo)產(chan)品層析完了，結合(he)墊(dian)還像沒層析過一(yi)樣，殘留的(de)不像話。這(zhe)種就適(shi)合(he)用偏疏水一(yi)些的(de)材(cai)質，釋(shi)放速度很(hen)快(kuai)，釋(shi)放殘留非(fei)常(chang)低，唯一(yi)的(de)缺(que)點(dian)就是得事(shi)先處理(li)才能(neng)用。通常(chang)情況，疏水的(de)墊(dian)子，cv把控(kong)(kong)中(zhong)規中(zhong)矩(ju)，噴金(jin)量偏大一(yi)些，相(xiang)對(dui)(dui)能(neng)把控(kong)(kong)的(de)很(hen)好。

D結合墊(dian)(dian)/樣品墊(dian)(dian)一(yi)體材(cai)(cai)質。目前國外的(de)一(yi)些(xie)廠家生產出了(le)pet材(cai)(cai)質的(de)一(yi)體墊(dian)(dian)，既具備玻纖親水性極佳的(de)特(te)點(dian)，又具備聚(ju)酯釋放均勻柔和(he)的(de)特(te)點(dian)，可以說是把優點(dian)集中(zhong)到一(yi)起了(le)吧，而(er)且用(yong)一(yi)個墊(dian)(dian)子(zi)，比用(yong)兩個墊(dian)(dian)子(zi)引入的(de)變異肯定更小。不(bu)過(guo)，它們材(cai)(cai)質普遍(bian)偏厚一(yi)些(xie)。

2.噴金(jin)or鋪金(jin)？烘(hong)干or凍干？

       這個方(fang)面大(da)家應該一目了然，從工(gong)序出現的(de)(de)(de)(de)時(shi)(shi)間(jian)先后就(jiu)可以(yi)(yi)推斷哪(na)種更(geng)好(hao)。鋪(pu)(pu)金(jin)的(de)(de)(de)(de)出現都是(shi)之前做膠體金(jin)定性(xing)產品的(de)(de)(de)(de)時(shi)(shi)候，那(nei)時(shi)(shi)候大(da)部(bu)分廠(chang)家都還是(shi)采用無(wu)紡布的(de)(de)(de)(de)年代，如果采用鋪(pu)(pu)金(jin)的(de)(de)(de)(de)工(gong)藝來做定量產品，并不是(shi)說(shuo)(shuo)不行，只(zhi)不過和噴金(jin)相比，確實(shi)CV更(geng)難把(ba)(ba)(ba)控(kong)，因(yin)為(wei)鋪(pu)(pu)金(jin)的(de)(de)(de)(de)均勻(yun)度和干(gan)燥過程中的(de)(de)(de)(de)動態變(bian)化是(shi)比較難以(yi)(yi)把(ba)(ba)(ba)控(kong)的(de)(de)(de)(de)。再說(shuo)(shuo)一下烘干(gan)和凍干(gan)，因(yin)為(wei)目前熒光顆(ke)粒(li)的(de)(de)(de)(de)粒(li)徑都在(zai)200nm以(yi)(yi)上(shang)，烘干(gan)其(qi)實(shi)很(hen)容(rong)易引發顆(ke)粒(li)的(de)(de)(de)(de)聚集或者嚴重的(de)(de)(de)(de)邊緣效應，凍干(gan)在(zai)保持蛋(dan)白活性(xing)和疏松程度方(fang)面都能很(hen)好(hao)把(ba)(ba)(ba)控(kong)，所(suo)以(yi)(yi)凍干(gan)毋庸(yong)置疑是(shi)優于(yu)烘干(gan)的(de)(de)(de)(de)。所(suo)以(yi)(yi)綜(zong)上(shang)來看，如果噴金(jin)配合凍干(gan)，理論上(shang)是(shi)最優的(de)(de)(de)(de)選擇。但是(shi)廠(chang)家還得考慮成本問題，在(zai)很(hen)多方(fang)面不得不做出取(qu)舍。

3.您(nin)的產品堵(du)膜了(le)嗎(ma)？

       微(wei)(wei)球(qiu)(qiu)的(de)標記我(wo)不(bu)(bu)(bu)想再(zai)談了，我(wo)只(zhi)說一(yi)下為什么有時(shi)(shi)候同一(yi)批(pi)次的(de)條子測(ce)試(shi)(shi)相近濃(nong)度(du)的(de)不(bu)(bu)(bu)同樣(yang)(yang)(yang)本(ben)，很多時(shi)(shi)候T和(he)C值差(cha)別非常(chang)大？我(wo)有時(shi)(shi)候會(hui)(hui)掰開卡(ka)殼觀察(cha)不(bu)(bu)(bu)同樣(yang)(yang)(yang)本(ben)的(de)測(ce)試(shi)(shi)狀態，發現(xian)微(wei)(wei)球(qiu)(qiu)都出現(xian)了不(bu)(bu)(bu)同程(cheng)度(du)的(de)堵膜，暫(zan)且不(bu)(bu)(bu)考慮(lv)不(bu)(bu)(bu)同樣(yang)(yang)(yang)本(ben)堵膜會(hui)(hui)有差(cha)異的(de)問題(ti)(ti)，就(jiu)說直接上樣(yang)(yang)(yang)本(ben)稀釋液就(jiu)有堵膜的(de)這種問題(ti)(ti)，能(neng)不(bu)(bu)(bu)能(neng)做出改善(shan)？對于層析產品，堵膜是(shi)一(yi)件(jian)非常(chang)糟(zao)糕的(de)事情，不(bu)(bu)(bu)僅CV不(bu)(bu)(bu)好，還會(hui)(hui)引入非常(chang)大的(de)偏差(cha)，準確度(du)都成了問題(ti)(ti)。所(suo)以我(wo)們(men)需要從(cong)各個方面考慮(lv)，如(ru)何讓我(wo)們(men)的(de)微(wei)(wei)球(qiu)(qiu)分散性(xing)更好，聚(ju)合形式比例更少。比如(ru)之前(qian)美牛生物提到的(de)，讓標記緩沖(chong)鹽離子濃(nong)度(du)降到很低等(deng)。

4.阻(zu)斷(duan)劑影響(xiang)到T和C了嗎？

       目前(qian)為了防止類風濕因(yin)子(zi)或者異(yi)嗜性(xing)抗體的(de)(de)(de)干擾，阻(zu)(zu)斷(duan)劑的(de)(de)(de)使用(yong)變得非常普遍，一(yi)般都是(shi)加在樣品墊(dian)處(chu)(chu)理(li)液里面(mian)(mian)。首先(xian)考(kao)慮這(zhe)個(ge)阻(zu)(zu)斷(duan)劑是(shi)不是(shi)鼠(shu)源的(de)(de)(de)，而(er)你的(de)(de)(de)C線(xian)(xian)用(yong)的(de)(de)(de)是(shi)不是(shi)羊抗鼠(shu)，這(zhe)樣的(de)(de)(de)話本身(shen)體系(xi)就(jiu)存在問題，導致(zhi)C線(xian)(xian)很(hen)(hen)弱；如(ru)果(guo)樣品墊(dian)處(chu)(chu)理(li)的(de)(de)(de)過(guo)程本身(shen)就(jiu)不均勻，那么C線(xian)(xian)的(de)(de)(de)高(gao)低起伏(fu)就(jiu)顯得很(hen)(hen)正常；同樣地，有(you)時候阻(zu)(zu)斷(duan)劑對(dui)于T線(xian)(xian)也就(jiu)是(shi)特異(yi)性(xing)反應也會有(you)干擾，不同的(de)(de)(de)樣本干擾程度還(huan)不一(yi)樣，這(zhe)又導致(zhi)了T線(xian)(xian)的(de)(de)(de)不穩定。所以從這(zhe)方面(mian)(mian)考(kao)慮，阻(zu)(zu)斷(duan)劑的(de)(de)(de)種類篩選和使用(yong)方法就(jiu)成了很(hen)(hen)有(you)必要的(de)(de)(de)一(yi)項工作。

5.樣本直接(jie)上樣？

       靈(ling)敏度不(bu)夠的(de)(de)(de)(de)時候(hou)，迫不(bu)得已(yi)采用的(de)(de)(de)(de)下策。我(wo)們(men)知道，血(xue)清(qing)樣(yang)本(ben)什么狀態的(de)(de)(de)(de)都有(you)(you)，有(you)(you)的(de)(de)(de)(de)像清(qing)水，有(you)(you)的(de)(de)(de)(de)像豆油(you)，還有(you)(you)溶血(xue)的(de)(de)(de)(de)像茶色的(de)(de)(de)(de)花(hua)生(sheng)油(you)。直(zhi)接上(shang)樣(yang)，有(you)(you)的(de)(de)(de)(de)爬速正常，有(you)(you)的(de)(de)(de)(de)根本(ben)爬不(bu)動，CV偏大也(ye)(ye)就(jiu)是家常便飯了(le)。還有(you)(you)的(de)(de)(de)(de)廠家測(ce)試(shi)指尖血(xue)，暫且不(bu)提紅細(xi)胞(bao)壓積的(de)(de)(de)(de)差異，我(wo)感覺(jue)做指尖血(xue)的(de)(de)(de)(de)定性對我(wo)來說就(jiu)挺(ting)難的(de)(de)(de)(de)，做定量？我(wo)都不(bu)想談CV這(zhe)個(ge)詞了(le)。不(bu)過，不(bu)管(guan)測(ce)全血(xue)還是血(xue)清(qing)，直(zhi)接上(shang)樣(yang)的(de)(de)(de)(de)話，濾血(xue)膜的(de)(de)(de)(de)使用都是必不(bu)可少的(de)(de)(de)(de)，它(ta)還多少能(neng)給(gei)試(shi)劑帶來一些(xie)正向作用。那么，如果(guo)測(ce)試(shi)的(de)(de)(de)(de)是血(xue)漿，不(bu)同(tong)的(de)(de)(de)(de)抗凝劑帶來的(de)(de)(de)(de)干擾，會不(bu)會引發大的(de)(de)(de)(de)變異，也(ye)(ye)得需要做嚴格(ge)的(de)(de)(de)(de)驗證。如果(guo)沒做驗證，那就(jiu)盡量測(ce)試(shi)血(xue)清(qing)，別(bie)整花(hua)活忽悠人。

6.您的卡殼(ke)設計的合理(li)嗎？

       卡殼(ke)？很多人(ren)并不在意(yi)，其實(shi)這是(shi)個(ge)加(jia)分項。加(jia)樣孔的(de)位置，結合墊處的(de)那兩(liang)個(ge)橫梁(liang)(liang)的(de)高低(di)，是(shi)我(wo)最為(wei)在意(yi)的(de)地方。加(jia)樣孔位置偏上，會引發持續或二次層(ceng)析(xi)；橫梁(liang)(liang)位置靠(kao)上，卡殼(ke)便(bian)失去了意(yi)義(yi)。恰到好(hao)處的(de)設計，能很大(da)程度地控制層(ceng)析(xi)，降低(di)變異。

       這里順便提一(yi)(yi)下吸水(shui)(shui)紙(zhi)的問題。有的吸水(shui)(shui)紙(zhi)蓄水(shui)(shui)量(liang)大(da)，但親水(shui)(shui)性差；有的則是親水(shui)(shui)性強，蓄水(shui)(shui)量(liang)低。選(xuan)(xuan)擇(ze)一(yi)(yi)款合適的吸水(shui)(shui)紙(zhi)，或者選(xuan)(xuan)取2款搭配使(shi)用，也(ye)是一(yi)(yi)個加分項。

7.膠體金定量or熒光微球定量？

       從之前的研發經驗和儀器對比來看，目前具體用哪種載體來定量已經變得沒那么重要了。膠體金的儀器目前響應已足夠靈敏，CV也并不輸于熒光儀器。如果從顆粒的大小來考慮，膠體金(20-40nm)在靈敏度方面確實比熒光微球(200-400nm)低一些。但是(shi)，有意思的(de)(de)是(shi)，對于上(shang)述提到的(de)(de)直接上(shang)樣的(de)(de)樣本(ben)，通常膠體金跑出來的(de)(de)CV，反而是(shi)優于熒光微球(qiu)的(de)(de)，它表現出的(de)(de)抗干擾能力更為(wei)出色，不(bu)知道是(shi)不(bu)是(shi)僅僅是(shi)出于顆粒大小的(de)(de)影響。

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