一、PCR反應組分

1.模板DNA：

來(lai)源比較(jiao)廣(guang)，用于復制(zhi)的(de)PCR模(mo)板(ban)可以是任何DNA來(lai)源，如(ru)基因組DNA（gDNA）、互補DNA（cDNA）和質粒DNA。不過(guo)(guo)，DNA的(de)組成或復雜度會(hui)影響PCR擴增的(de)最佳起(qi)始(shi)(shi)量(liang)。例(li)如(ru)，在起(qi)始(shi)(shi)量(liang)為(wei)50μL 的(de)PCR中(zhong)，只(zhi)需0.1–1 ng質粒DNA，而(er)gDNA則(ze)需要5–50ng。最佳模(mo)板(ban)起(qi)始(shi)(shi)量(liang)還取決于所使用的(de) DNA 聚(ju)合酶(mei)類型；經過(guo)(guo)改造 的(de)DNA聚(ju)合酶(mei)對模(mo)板(ban)的(de)親和力更(geng)強，靈敏度更(geng)高，所需的(de)DNA起(qi)始(shi)(shi)量(liang)更(geng)少。對DNA起(qi)始(shi)(shi)量(liang)的(de)優化很重要，因為(wei)起(qi)始(shi)(shi)量(liang)過(guo)(guo)高會(hui)增加發生非(fei)特異性擴增的(de)風險(xian)，而(er)起(qi)始(shi)(shi)量(liang)過(guo)(guo)低會(hui)降低得率。

有時(shi)候，PCR實驗(yan)方案(an)會使用(yong)拷貝(bei)數(shu)(shu)表示(shi)DNA起始(shi)量，特(te)別(bie)是gDNA。拷貝(bei)數(shu)(shu)的(de)計算取決于分子的(de)數(shu)(shu)量，即DNA起始(shi)摩爾(er)量。用(yong)Avogadro常數(shu)(shu)（L）和摩爾(er)質量計算拷貝(bei)數(shu)(shu)，公式如下：

拷貝數(shu)=L×摩爾數(shu)=L×（總質(zhi)量/摩爾質(zhi)量）

特定DNA鏈的摩爾(er)質量取決于(yu)其大(da)小(xiao)或總堿基數（即其長度和單鏈或雙鏈特性的組合）。

理論上，單拷貝DNA或單個細胞在理想條件下足夠用于PCR擴增。但在實際情況中，特定模板量的擴增效率很大程度上取決于反應組分和反應參數，以及DNA聚合酶的靈敏度。

除了gDNA、cDNA和質粒DNA，可通過再次擴增PCR產物，得到更高的目標DNA得率。盡管未純化的PCR產物可以直接再次用作模板，但是引物、dNTP、鹽和副產物等遺留反應成分會對擴增造成不利影響。為了避免這種抑制作用，通常建議在下一輪PCR前用水稀釋反應。如需獲取最佳結果，應在再次擴增前將PCR擴增子進行純化。

模板DNA的量與純化程度，是PCR成敗與否的關鍵環節之一，傳統的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。SDS的主要功能是：溶解細胞膜上的脂類與蛋白質，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質結合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白質，特別是與DNA結合的組蛋白，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組分，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應。一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離，直接用于PCR擴增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

2.脫氧(yang)核苷三磷酸(suan)（dNTP）：

四種dNTP（dATP、dCTP、dGTP和dTTP）是PCR原(yuan)料，其比例(li)和濃(nong)度與PCR密切相(xiang)關(guan)。dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性(xing)(xing)失去生物(wu)學(xue)活性(xing)(xing)。dNTP溶液(ye)呈酸性(xing)(xing)，使(shi)用時應(ying)用1M NaOH或1M Tris配成(cheng)高濃(nong)度后，HCI的緩沖液(ye)將其pH調節到7.0～7.5，小(xiao)量(liang)分裝，-20℃冰凍(dong)保存。多(duo)次凍(dong)融會使(shi)dNTP降解。在PCR反應(ying)中，dNTP應(ying)為50～200 μmol/L，尤其是注意4種dNTP的濃(nong)度要(yao)相(xiang)等(deng)(等(deng)摩(mo)爾(er)配制)，如其中任何一種濃(nong)度不同(tong)于其它幾種時(偏高或偏低(di))，就會引起錯配。濃(nong)度過(guo)低(di)又會降低(di)PCR產物(wu)的產量(liang)。但是，在某些情(qing)況下，如通(tong)過(guo)PCR方法進(jin)行隨機突(tu)變，偶爾(er)也會使(shi)用濃(nong)度不等(deng)的dNTP，以促進(jin)非(fei)校正DNA聚合酶產生更多(duo)的錯誤堿基插入。

dNTP儲存液(ye)：dNTP溶于(yu)pH為7.0的(de)NaOH貯存液(ye)中，最(zui)初的(de)貯存液(ye)可稀(xi)釋到10mol/L，分裝后存放在(zai)-20℃冰箱中。dNTP使用(yong)濃度在(zai)20～200μmol/L之間(jian)。4種dNTP必須等濃度配(pei)合(he)以減少(shao)錯(cuo)配(pei)誤(wu)差。

dNTP使用濃度：在PCR反應中，使用低dNTP濃度，可減少非靶位置啟動和延伸時的核苷酸錯誤摻入。在常見的PCR應用中，各種dNTP的常用終濃度通常為0.2mM。一般可根據靶序列的長度和組成來決定最低dNTP濃度。例如在100μl的反應體系中，4種dNTP的濃度為20 μmol/L，可基本滿足合成2.6μgDNA或10pmol/L的400bp序列。使用低dNTP濃度(每種dNTP濃度為2μmol/L)，能夠高度靈敏地(1/107)擴增ras基因點突變的等位基因。

有時，使用高濃度dNTP也可能也是有益的，特別是在存在高濃度 Mg2+的情況下，因為Mg2+可與dNTP結合，減少可被引入的dNTP量。但同時，當dNTP超過最佳濃度時，會抑制PCR反應。為使DNA聚合酶完成有效擴增，反應中的游離dNTP濃度不得超過 0.010–0.015mM（其估計Km值）。當使用非校正DNA聚合酶時，可通過降低dNTP濃度（0.01–0.05 mM）和成比例減少 Mg2+來提高保真度。

3.Taq DNA聚合酶：

DNA聚合(he)(he)(he)酶(mei)是PCR的重要組成(cheng)部分，它(ta)們(men)能夠從(cong)單鏈DNA模(mo)板合(he)(he)(he)成(cheng)新的互補鏈。所(suo)有(you)DNA聚合(he)(he)(he)酶(mei)都(dou)具(ju)有(you) 5′→ 3′ 聚合(he)(he)(he)酶(mei)活性，即摻入核(he)苷(gan)酸并使引物從(cong)按5'至3’方向延伸(shen)。

早期的(de)(de)(de)PCR，通常使用來源于大腸桿(gan)菌的(de)(de)(de)DNA聚合(he)酶I上的(de)(de)(de) Klenow片段 來生成(cheng)新的(de)(de)(de)子(zi)鏈。但是，這種(zhong)大腸桿(gan)菌酶對熱敏(min)感，易受(shou)到變性階段高(gao)溫度的(de)(de)(de)破(po)壞，從而無法繼(ji)續進行退火和延伸步驟。因此，需要在全(quan)程每個循環的(de)(de)(de)退火步驟中重新補充(chong)酶。

熱穩定DNA聚合酶的發現是一項重大進步。它實現了長時間的反應穩定性，為PCR方法的改進提供了無限可能。1976年，從耐熱菌Thermus aquaticus中分離出來的Taq DNA 聚合酶是最有名的熱穩定DNA聚合酶之一 。1988年研究人員首次報道，證明TaqDNA聚合酶能夠在 75℃以上保持活性，從而無需手動加入新鮮的酶即可持續循環擴增，實現了工作流程自動化。此外，與大腸桿菌 DNA聚合酶相比，Taq DNA 聚合酶能夠獲得更長的PCR擴增子，并且具有更高的靈敏度、特異性和得率。也因此，Taq DNA 聚合酶被《科學》雜志評為1989年的“年度分子”。

盡管 Taq DNA聚合酶大大改善了PCR實驗方法，但也表現出一些缺點。例如，Taq DNA 聚合酶在90℃以上的DNA鏈變性溫度中相對不穩定。對于需要更高解離溫度的富含GC和/或具有強二級結構的DNA模板而言，這一問題尤為明顯。同時，Taq DNA 酶還缺乏校正活性，會在擴增期間引入錯誤核苷酸。對于克隆和測序而言，序列的準確性至關重要，所以不能存在含有錯配的PCR擴增子。此外，Taq DNA 聚合酶的易錯配特性使其通常無法穩定擴增長度大于5kb的片段。為克服這些缺點，性能更好的DNA聚合酶不斷被開發出來，使PCR在廣泛的生物學應用中發揮其強大的功能。

目前有兩種Taq DNA聚合酶供應， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化--典型的PCR反應約需酶量2.5U（指總反應體積為100 ul時），濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少。

4.引物：

PCR引(yin)物是(shi)含有(you)(you)15-30個堿(jian)基的(de)(de)(de)(de)合成(cheng)DNA寡核苷酸(suan)。能夠與模板DNA中目(mu)標(biao)區域的(de)(de)(de)(de)側翼序(xu)(xu)列(lie)結合（通(tong)過序(xu)(xu)列(lie)互(hu)補）。在PCR反應期間，DNA聚合酶(mei)從 3′端開始延伸引(yin)物。因此(ci)，引(yin)物結合位(wei)點(dian)必須(xu)是(shi)靶(ba)標(biao)附近所(suo)特(te)有(you)(you)的(de)(de)(de)(de)，并(bing)且(qie)與起始DNA的(de)(de)(de)(de)其它部分序(xu)(xu)列(lie)具有(you)(you)最小的(de)(de)(de)(de)同源性(xing)，以確保目(mu)的(de)(de)(de)(de)片段的(de)(de)(de)(de)特(te)異性(xing)擴(kuo)增(zeng)。

除了序(xu)列(lie)同(tong)源性(xing)，引(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)(wu)還必須考慮到其它(ta)相關問題，，以確保PCR擴(kuo)增的(de)(de)特(te)異(yi)性(xing)。首先，引(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)(wu)序(xu)列(lie)的(de)(de)熔解溫(wen)度（Tm）必須在 55–70℃之間，兩種(zhong)引(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)(wu)的(de)(de) Tm相差不(bu)超(chao)過 5℃。同(tong)樣(yang)重(zhong)要的(de)(de)是，引(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)(wu)的(de)(de)序(xu)列(lie)不(bu)能(neng)具有互(hu)補性(xing)（特(te)別是3’末端），若兩個引(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)(wu)互(hu)補會(hui)促(cu)進退(tui)火（即，引(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)(wu)二聚體），自我互(hu)補會(hui)導致自我配(pei)對(dui)（即，二級結構(gou)），或(huo)(huo)序(xu)列(lie)的(de)(de)直接重(zhong)復(fu)會(hui)導致與模板目(mu)標區域產生(sheng)不(bu)完全配(pei)對(dui)。引(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)(wu)的(de)(de)GC含(han)量最好(hao)在40-60%之間，均(jun)勻的(de)(de)C和(he)G分布能(neng)夠避免錯(cuo)誤發生(sheng)。同(tong)樣(yang)，為了盡(jin)量減(jian)少非(fei)特(te)異(yi)性(xing)，引(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)(wu)3′端最多(duo)只能(neng)含(han)有3個G或(huo)(huo)C堿基。另一方面(mian)，引(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)(wu)3′端含(han)有1個C或(huo)(huo)G核苷酸(suan)有利于引(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)(wu)的(de)(de)錨定和(he)延伸。

引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板 DNA在體外大量擴增。

長序列引物（如，>50 nt）或堿基經修飾的引物通常需要進行 純化 ，以去除非全長產物和未結合的核苷酸。對于分子克隆和突變等應用，建議將引物進行純化，序列和長度的完整性對于實驗的成功至關重要。

為PCR克隆設計引物時，可在5'末端引入限制性酶切位點、重組序列和啟動子結合位點等延伸的非模板序列。這些延伸序列需進行精心設計，以盡量減小對PCR擴增和下游實驗應用的影響。

在配制PCR反應體系時，引物加入量應在0.1–1μM范圍內。對于含有簡并堿基或用于長片段PCR擴增的引物，常用的引物濃度為0.3–1μM 。通常，建議先使用標準濃度，然后根據需要再進行調整。引物濃度過高容易產生錯配和非特異性擴增。而引物濃度過低可能會導致目的片段的少量擴增或無擴增。

5.鎂離子（Mg2+）：

鎂離(li)子(zi)（Mg2+）作為DNA聚合(he)酶(mei)活(huo)性(xing)的(de)輔助因子(zi)，有助于聚合(he)期間(jian)dNTP的(de)結合(he)。酶(mei)活(huo)性(xing)位(wei)點(dian)處的(de)鎂離(li)子(zi)可催化引(yin)物的(de)3′-OH與dNTP的(de)磷酸(suan)(suan)基團間(jian)形成磷酸(suan)(suan)二(er)酯(zhi)鍵。此外，Mg2+  能夠(gou)穩定磷酸(suan)(suan)鹽(yan)骨架上的(de)負電荷(he)，從而促進引(yin)物與DNA模板(ban)形成復合(he)物。

通常情況下，Mg2+ 以MgCl2 的形式提供。但是，因硫酸鹽在某些情況下有助于確保更穩定和可重現的性能，諸如 Pfu DNA聚合酶等一些聚合酶首選MgSO4。由于鎂離子能夠與dNTP、引物、DNA模板和EDTA（如果存在）結合，因此，通常需要對鎂離子濃度進行優化，以盡量提高PCR得率，并保持其擴增特異性。

在PCR中，標準的 Mg2+ 終濃度范圍為1–4mM，建議優化滴定增量為0.5mM。Mg2+ 濃度過低會降低Taq DNA聚合酶活性，導致PCR產物較少或無PCR產物。另一方面，Mg2+ 濃度過高則會提高引物-模板復合物的穩定性，反應特異性降低，產生非特異性PCR產物，并增加由dNTP錯誤插入導致的復制錯誤。

6.緩沖液：

用(yong)于維持DNA聚合酶的活性和穩定性。緩沖液pH通常為8.0-9.5，一般使用(yong)Tris-HCl來調節。

對于 Taq DNA 聚合酶，緩沖液的一個常見成分是來自KCl的鉀離子（K+)，其可促進引物的吸附。有時，也可使用硫酸銨(NH4)2SO4 代替KCl。銨離子(NH4+) 具有去穩定作用，尤其對于錯配引物-模板復合物堿基對之間的弱氫鍵，因此可增強反應特異性。

鉀離(li)(li)子和鎂離(li)(li)子 (K+和 Mg2+) 能(neng)夠(gou)與DNA骨架(jia)上的磷酸基團 (P–) 結合并穩定(ding)雙(shuang)鏈形成，而銨離(li)(li)子 (NH4+) 能(neng)夠(gou)與堿基（N）之間的氫鍵相互作用并破壞雙(shuang)鏈形成。

由于(yu) Mg2+ 與K+具(ju)有(you)相似的(de)(de)(de)穩定效應(ying)，因(yin)此，當(dang)使用(yong)KCl緩(huan)(huan)沖(chong)(chong)(chong)(chong)液時，MgCl2 的(de)(de)(de)建(jian)議濃度(du)通常(chang)(chang)較(jiao)低(1.5 ± 0.25 mM) ，當(dang)使用(yong)(NH4)2SO4 緩(huan)(huan)沖(chong)(chong)(chong)(chong)液時，MgCl2的(de)(de)(de)建(jian)議濃度(du)通常(chang)(chang)較(jiao)高 (2.0 ± 0.5 mM)。由于(yu)NH4+ 與Mg2+具(ju)有(you)拮(jie)抗效應(ying)，因(yin)此，在各種(zhong) Mg2+ 濃度(du)下，含(han)有(you)(NH4)2SO4 的(de)(de)(de)緩(huan)(huan)沖(chong)(chong)(chong)(chong)液都表現出(chu)更(geng)高的(de)(de)(de)引物特異性。由于(yu)最佳的(de)(de)(de)PCR緩(huan)(huan)沖(chong)(chong)(chong)(chong)液取決于(yu)所(suo)使用(yong)的(de)(de)(de)DNA聚合酶類型，所(suo)以(yi)有(you)必(bi)要遵循酶供應(ying)商的(de)(de)(de)提供的(de)(de)(de)緩(huan)(huan)沖(chong)(chong)(chong)(chong)液建(jian)議。

在某些情(qing)況(kuang)下(xia)，可在緩(huan)沖液(ye)中(zhong)加入化學(xue)添(tian)加劑(ji)或(huo)輔(fu)助(zhu)(zhu)溶(rong)劑(ji)，通(tong)過減(jian)少錯配(pei)來提(ti)高擴增(zeng)特異性(xing)，并(bing)通(tong)過去(qu)除二(er)級(ji)結構來提(ti)高擴增(zeng)效率。此(ci)外，一些DNA聚合酶(mei)還隨附提(ti)供了專(zhuan)為DNA聚合酶(mei)和PCR緩(huan)沖液(ye)優化的(de)特殊增(zeng)強劑(ji)。這些試劑(ji)常用(yong)于困難(nan)樣品，如富含GC的(de)模板。應注意，使用(yong)化學(xue)添(tian)加劑(ji)或(huo)輔(fu)助(zhu)(zhu)溶(rong)劑(ji)會影(ying)響引物退火、模板變性(xing)、 Mg2+ 結合以及酶(mei)活性(xing)。同(tong)時，它們還會干擾某些下(xia)游應用(yong)——例如，基因(yin)芯片實驗(yan)中(zhong)的(de)非離子去(qu)污(wu)劑(ji)。因(yin)此(ci)，為了成(cheng)功進行PCR擴增(zeng)和下(xia)游實驗(yan)應用(yong)，應慎重考慮緩(huan)沖液(ye)組成(cheng)成(cheng)分。

7.熱循環儀:

熱(re)循(xun)(xun)環(huan)儀是(shi)一種(zhong)能(neng)夠為(wei)PCR反應自動(dong)(dong)完成溫度循(xun)(xun)環(huan)和(he)(he)孵(fu)育的(de)(de)儀器(qi)。在(zai)引入熱(re)循(xun)(xun)環(huan)儀之(zhi)前(qian)，PCR反應是(shi)一個(ge)(ge)費(fei)時(shi)費(fei)力(li)的(de)(de)過程，需(xu)在(zai)不同溫度的(de)(de)水浴之(zhi)間轉(zhuan)移(yi)樣品，并為(wei)每個(ge)(ge)步(bu)驟需(xu)要精確定時(shi)。熱(re)循(xun)(xun)環(huan)儀和(he)(he) Taq DNA 聚(ju)合(he)酶的(de)(de)發現(xian)，讓PCR的(de)(de)自動(dong)(dong)化成為(wei)現(xian)實。第一款(kuan)自動(dong)(dong)化PCR熱(re)循(xun)(xun)環(huan)儀是(shi)在(zai)1985年(nian)由PerkinElmer和(he)(he)Cetus以(yi)合(he)資(zi)方式(shi)引入市場的(de)(de)。

二、PCR反應條件

1.變性溫度與時間

模板(ban)變性(xing)溫度(du)是決定PCR反應中(zhong)雙鏈(lian)DNA解鏈(lian)的溫度(du)，達不(bu)到變性(xing)溫度(du)就(jiu)不(bu)會產生單鏈(lian)DNA模板(ban)，PCR也(ye)就(jiu)不(bu)會啟動。變性(xing)溫度(du)低則(ze)變性(xing)不(bu)完全，DNA雙鏈(lian)會很快復性(xing)，因而減(jian)少(shao)產量(liang)(liang)。變性(xing)溫度(du)太高(gao)，又會影響酶的活(huo)性(xing)，一(yi)般(ban)情況下可設為94℃ 20-30秒，高(gao)溫時(shi)間應盡量(liang)(liang)縮短，以(yi)保持耐熱DNA聚合酶的活(huo)力，最高(gao)變性(xing)溫度(du)不(bu)宜超過(guo)95℃。

2.退火溫度與實踐

退(tui)火(huo)溫度(du)(du)決定(ding)PCR特異(yi)性(xing)與產(chan)量(liang)。溫度(du)(du)高特異(yi)性(xing)強，但(dan)過(guo)高則引(yin)物(wu)不能(neng)與模(mo)板(ban)牢固結合(he)，DNA擴(kuo)增(zeng)效率(lv)下降；溫度(du)(du)低(di)產(chan)量(liang)高，但(dan)過(guo)低(di)可(ke)造成引(yin)物(wu)與模(mo)板(ban)錯配，非(fei)特異(yi)性(xing)產(chan)物(wu)增(zeng)加。合(he)適(shi)的(de)退(tui)火(huo)溫度(du)(du)一般(ban)在45-68℃之間。設置特定(ding)反應的(de)最適(shi)退(tui)火(huo)溫度(du)(du)，可(ke)根據引(yin)物(wu)的(de)（G+C）%含量(liang)進行推(tui)測，一般(ban)實(shi)驗中退(tui)火(huo)溫度(du)(du)比擴(kuo)增(zeng)引(yin)物(wu)的(de)熔解溫度(du)(du)Tm低(di)5℃，退(tui)火(huo)時間一般(ban)為30-60秒，足以(yi)使引(yin)物(wu)與模(mo)板(ban)之間結合(he)，沒有(you)必要長時間退(tui)火(huo)。

3.延伸溫度(du)與時間

PCR反應的延(yan)伸(shen)溫度一般選擇在70-75℃之間，延(yan)伸(shen)時間根據所有(you)聚合酶(mei)擴(kuo)增(zeng)速度和擴(kuo)增(zeng)片段(duan)大小設定。如同樣擴(kuo)增(zeng)2kb片段(duan)，若使用(yong)Taq酶(mei)只需要1分(fen)鐘，使用(yong)Pfu酶(mei)則(ze)應設定2分(fen)鐘以(yi)上。延(yan)伸(shen)時間過(guo)長會導致非特(te)異性擴(kuo)增(zeng)帶(dai)的出(chu)現。時間太(tai)短(duan)則(ze)可能得(de)(de)不到擴(kuo)增(zeng)產(chan)物或得(de)(de)到一些短(duan)的非特(te)異性片段(duan)。

4.循環次數

可根據模板DNA的(de)(de)(de)量，擴增(zeng)片段的(de)(de)(de)大(da)小和擴增(zeng)產(chan)物(wu)的(de)(de)(de)下(xia)步應用等(deng)因素，設定30-40個循(xun)環。循(xun)環次數(shu)太少(shao)，擴增(zeng)量不足，如果循(xun)環次數(shu)太多，錯(cuo)配幾率會(hui)增(zeng)加(jia)，非特異(yi)性背景(jing)嚴重(zhong)。所以，在保證產(chan)物(wu)得率的(de)(de)(de)前提下(xia)，應盡量減少(shao)循(xun)環次數(shu)。